2) применять процедуру дифференциального лизиса (+)
3) осаждение ДНК проводить ультрамикрофильтрацией
4) проводить концентрирование полученных препаратов ДНК
Правильный подход — дифференциальный лизис. При исследовании биологических следов после полового преступления часто анализируют смешанный материал, содержащий эпителиальные клетки потерпевшей и сперматозоиды предполагаемого преступника. Последовательное разрушение клеток позволяет разделить эти клеточные фракции и получить отдельные препараты ДНК для последующего STR-профилирования.
На первом этапе эпителиальные клетки лизируют мягкими условиями с применением детергентов и протеиназы K, тогда как сперматозоиды сохраняются в осадке благодаря устойчивости их ядерных оболочек, обусловленной дисульфидными связями протаминов. После центрифугирования супернатант содержит преимущественно ДНК эпителиальных клеток, а осадок сперматозоидов подвергают дополнительному лизису с дитиотреитолом или другим восстановителем. Это разрушает дисульфидные связи и обеспечивает высвобождение сперматозоидной ДНК.
Дифференциальный лизис снижает риск маскирования мужского генетического профиля избытком женской ДНК и повышает вероятность получения информативной смешанной либо мужской STR-картины. Дополнительная очистка или концентрирование могут применяться по показаниям и в рамках валидированной методики, но не заменяют этап клеточного разделения; ультрафильтрация также относится к способам разделения или концентрирования, а не к стандартному осаждению ДНК.
| Этап или фракция | Основная цель | Ключевой принцип | Ожидаемый результат |
|---|---|---|---|
| Исходный биологический след | Выявление клеточного материала в мазке или на объекте | Материал обычно является смешанным | Одновременное присутствие эпителиальных клеток и, возможно, сперматозоидов |
| Мягкий первичный лизис | Разрушение несперматозоидных клеток | Детергент и протеиназа K при условиях, сохраняющих сперматозоиды | ДНК эпителиальной фракции переходит в раствор |
| Центрифугирование и разделение | Физическое отделение клеточных фракций | Растворённая ДНК остаётся в супернатанте, сперматозоиды — в осадке | Формирование несперматозоидной и сперматозоидной фракций |
| Супернатант | Исследование ДНК эпителиальных клеток | Выделение ДНК без разрушения сперматозоидного осадка | Преимущественно генетический профиль потерпевшей или другого источника эпителия |
| Восстановительный лизис осадка | Высвобождение ДНК сперматозоидов | Дитиотреитол разрывает дисульфидные связи протаминов | Получение ДНК преимущественно мужского происхождения |
| Раздельное STR-типирование | Установление генетических профилей | Анализ коротких тандемных повторов в отдельных фракциях | Повышение различимости индивидуальных компонентов смеси |
| Обычный недифференциальный лизис | Одновременное выделение всей клеточной ДНК | Фракции не разделяются до экстракции | Риск преобладания женского профиля и снижения информативности мужского компонента |
Дифференциальный лизис особенно важен при небольшом количестве сперматозоидов и значительном избытке эпителиальной ДНК. Полученные фракции должны обрабатываться раздельно с соблюдением мер против перекрёстной контаминации и обязательным включением контрольных образцов. Интерпретация генетических профилей проводится с учётом качества материала, количества аллелей и вероятности смешанного происхождения ДНК.