2) полимеразной цепной реакции
3) анализа продуктов амплификации (+)
4) общего назначения
Постановка секвенирующих реакций, очистка полученных продуктов и последующий секвенирующий электрофорез относятся к постамплификационному этапу, то есть к зоне анализа продуктов амплификации. Для типирования полиморфизмов митохондриальной ДНК обычно применяют секвенирование по Сэнгеру: очищенный ампликон используют как матрицу, а в реакцию вносят праймер, ДНК-полимеразу, обычные дезоксинуклеотиды и флуоресцентно меченные дидезоксинуклеотиды. Обрыв цепи в местах включения дидезоксинуклеотидов формирует набор фрагментов, по которому при капиллярном электрофорезе определяется последовательность нуклеотидов.
После ПЦР в лаборатории присутствует большое количество копий целевой последовательности — ампликонов. Поэтому любые операции с ними, включая подготовку секвенирующих смесей, удаление избытка праймеров и нуклеотидов, а также загрузку очищенных продуктов на прибор, выполняют в отдельной пост-ПЦР-зоне. Такое зонирование предотвращает перенос ампликонов в помещения первичной обработки или постановки ПЦР, где они могут стать источником контаминации и привести к ложному выявлению аллеля либо к искажению митохондриального гаплотипа.
Зона анализа продуктов амплификации должна иметь выделенное оборудование и расходные материалы; соблюдаются однонаправленный поток образцов, смена перчаток, применение фильтрующих наконечников и регулярная деконтаминация рабочих поверхностей. Отнесение секвенирования к этой зоне определяется не видом исследуемой ДНК, а технологической последовательностью: все перечисленные процедуры выполняются с уже полученным ПЦР-продуктом и несут повышенный риск постамплификационного загрязнения.
| Этап исследования | Основной материал | Типичные операции | Зона выполнения | Ключевой риск или контроль |
|---|---|---|---|---|
| Первичная обработка объектов | Биологический объект, исходный материал | Осмотр, отбор, выделение клеточного материала и ДНК | Зона первичной обработки | Предупреждение внешней и межобразцовой контаминации |
| Подготовка ПЦР | Выделенная ДНК, праймеры, реакционная смесь | Дозирование компонентов и постановка амплификации | Зона ПЦР | Исключение попадания готовых ампликонов в реакцию |
| Амплификация | ПЦР-смесь с матричной ДНК | Термоциклическое копирование участка мтДНК | Зона ПЦР | Использование отрицательных контролей и контроль работы термоциклера |
| Постановка секвенирующей реакции | Очищенный ПЦР-ампликон | Реакция удлинения с флуоресцентными дидезоксинуклеотидами | Зона анализа продуктов амплификации | Работа только с пост-ПЦР-материалом и выделенным инвентарём |
| Очистка секвенирующих продуктов | Фрагменты ДНК после реакции Сэнгера | Удаление свободных красителей, праймеров и непрореагировавших нуклеотидов | Зона анализа продуктов амплификации | Предотвращение переноса высококонцентрированных продуктов |
| Секвенирующий электрофорез | Очищенные флуоресцентно меченные фрагменты | Капиллярное разделение и регистрация электрофореграммы | Зона анализа продуктов амплификации | Оценка качества сигнала, высоты пиков и артефактов чтения |
| Интерпретация последовательности | Электрофореграмма и референсная последовательность мтДНК | Выявление замен, гетероплазмии и сопоставление вариантов | Зона анализа результатов | Проверка контрольных образцов и исключение смешанного профиля |
Таким образом, правильная локализация всех перечисленных процедур — зона анализа продуктов амплификации. Она соответствует пост-ПЦР-этапу и обеспечивает физическое разделение потенциально загрязняющего материала от исходных образцов и реакций амплификации. Для судебно-генетического исследования особенно важны отрицательные контроли, прослеживаемость образцов и независимое подтверждение сомнительных вариантов. При анализе мтДНК дополнительно учитывают её высокую копийность и возможность гетероплазмии, поэтому требования к предотвращению контаминации имеют принципиальное значение.