2) 72-75
3) 56-60
4) 40-55
Денатурация в полимеразной цепной реакции обычно проводится при температуре 93–95 °C. При нагревании разрушаются водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями, вследствие чего двухцепочечная молекула ДНК разделяется на две одноцепочечные матрицы. Фосфодиэфирные связи сахарофосфатного остова при этом не разрываются, поэтому каждая цепь сохраняет последовательность, необходимую для последующего синтеза.
Разделение цепей является первым этапом каждого цикла амплификации и обеспечивает доступ праймеров к комплементарным участкам ДНК. После снижения температуры праймеры гибридизуются с матрицей, а термостабильная ДНК-полимераза достраивает новые цепи преимущественно при 72–75 °C. Оптимальный режим денатурации должен быть достаточно высоким для полного расплетания ДНК, но не чрезмерным, чтобы не снижать активность фермента и не повреждать исследуемый материал.
В судебно-медицинской экспертной практике этот принцип используется при амплификации коротких тандемных повторов, митохондриальной ДНК и других генетических маркеров. В каждом последующем цикле количество целевых ампликонов теоретически удваивается, что позволяет исследовать даже малые или частично деградированные биологические следы.
| Этап ПЦР | Ориентировочная температура | Основное молекулярное событие | Назначение |
|---|---|---|---|
| Начальная денатурация | 94–95 °C | Первичное полное разделение цепей исходной ДНК | Подготовка матрицы к первому циклу амплификации |
| Циклическая денатурация | 93–95 °C | Разрыв водородных связей между комплементарными цепями | Образование одноцепочечных матриц для присоединения праймеров |
| Отжиг праймеров | Обычно 50–65 °C | Гибридизация праймеров с комплементарными последовательностями | Определение границ амплифицируемого фрагмента и специфичности реакции |
| Элонгация | 72–75 °C | Присоединение нуклеотидов термостабильной ДНК-полимеразой | Синтез новых цепей ДНК |
| Финальная элонгация | 72–75 °C | Завершение достройки неполных ампликонов | Повышение полноты конечного продукта реакции |
| Охлаждение и хранение | Около 4–10 °C | Стабилизация полученных ампликонов | Сохранение продукта до электрофоретического или иного анализа |
Температуры 56–60 °C чаще соответствуют этапу отжига праймеров, а не денатурации. Диапазон 72–75 °C характерен для работы Taq-полимеразы на стадии синтеза новой цепи. Поэтому температура 93–95 °C является диагностически и методически правильной характеристикой этапа разъединения цепей ДНК в стандартной ПЦР. Точный протокол может незначительно изменяться в зависимости от состава реакционной смеси, длины ампликона и типа полимеразы.