2) разрушения клеточных мембран
3) отделения белков от ДНК (+)
4) связывания молекул ДНК
Смесь фенола с хлороформом применяют при экстракции нуклеиновых кислот для удаления белковых примесей из биологического материала. Фенол нарушает пространственную структуру белков, разрушая водородные и гидрофобные взаимодействия, вследствие чего белковые молекулы денатурируют и теряют растворимость в водной фазе. Хлороформ усиливает разделение фаз, способствует удалению липидов и уменьшает остаточное содержание фенола в водном растворе.
После центрифугирования образуются водная и органическая фазы, между которыми располагается интерфаза. При нейтральном или слабощелочном значении pH ДНК сохраняется преимущественно в верхней водной фазе, денатурированные белки концентрируются в интерфазе, а липиды и гидрофобные компоненты переходят в нижнюю органическую фазу. Полученную водную фракцию затем осторожно отбирают, после чего ДНК обычно осаждают этанолом или изопропанолом.
В судебно-генетическом исследовании такая очистка позволяет уменьшить влияние гемоглобина, ферментов, мембранных белков и других ингибиторов полимеразной цепной реакции. Метод особенно эффективен при обработке сложных биологических объектов, однако требует точного соблюдения условий экстракции, поскольку остаточные количества фенола могут подавлять амплификацию ДНК.
| Компонент или этап | Основное действие | Результат |
|---|---|---|
| Фенол | Денатурирует белки за счёт нарушения нековалентных связей | Белки утрачивают нативную структуру и удаляются из водной фазы |
| Хлороформ | Улучшает разделение водной и органической фаз, экстрагирует липиды | Формируется чёткая граница фаз, повышается чистота препарата ДНК |
| Водная фаза | Сохраняет растворённые нуклеиновые кислоты при нейтральном или слабощелочном pH | Содержит основную часть выделенной ДНК |
| Интерфаза | Накапливает денатурированные белки и клеточный детрит | Не должна попадать в отбираемую водную фракцию |
| Органическая фаза | Удерживает фенол, хлороформ, липиды и гидрофобные белковые компоненты | Отделяется от раствора нуклеиновых кислот |
| Осаждение спиртом | Снижает растворимость ДНК в присутствии солей | Позволяет сконцентрировать и дополнительно очистить ДНК |
| Контроль чистоты | Оценивает наличие белков и органических примесей | Определяет пригодность образца для ПЦР и генотипирования |
Фенол-хлороформная экстракция обеспечивает получение высокомолекулярной ДНК с хорошей степенью очистки и остаётся референсным лабораторным подходом для ряда сложных образцов. Её недостатками являются токсичность реагентов, трудоёмкость и риск потери материала при переносе водной фазы. Для следовых количеств ДНК чаще применяют сорбционные колонки или магнитные частицы, поскольку эти методы легче стандартизировать и автоматизировать. Независимо от способа выделения, качество очистки непосредственно влияет на достоверность последующего генетического профилирования.