2) энзимоскопию
3) микроскопирование
4) флуоресцентную детекцию (+)
При ПЦР по конечной точке результат оценивают после завершения заданного числа циклов амплификации, когда в реакционной смеси накопился специфический ампликон. Флуоресцентная детекция основана на регистрации светового сигнала, возникающего при связывании интеркалирующего красителя с двуцепочечной ДНК либо при расщеплении флуоресцентно меченого зонда. Интенсивность сигнала сравнивают с отрицательным контролем и, при необходимости, с положительным контролем; превышение установленного порога свидетельствует о наличии продукта амплификации.
Для endpoint-ПЦР характерна именно регистрация конечного флуоресцентного сигнала, в отличие от ПЦР в реальном времени, при которой флуоресценцию измеряют после каждого цикла и анализируют кинетику накопления продукта, включая значение Cq/Ct. В судебно-медицинской практике флуоресцентно меченые праймеры или зонды позволяют выявлять специфические участки ДНК, в том числе аллельные варианты и маркерные последовательности, при исследовании биологических следов.
Тонкослойная хроматография не является стандартным способом регистрации амплифицированной ДНК, поскольку предназначена главным образом для разделения низкомолекулярных соединений. Энзимоскопия оценивает активность ферментов, а микроскопирование не обеспечивает специфичного выявления большинства продуктов ПЦР. Поэтому среди представленных вариантов наиболее корректным методом регистрации результата является флуоресцентная детекция.
| Подход | Регистрируемый объект | Принцип | Особенности применения |
|---|---|---|---|
| Флуоресцентная детекция по конечной точке | Накопленный ампликон после завершения реакции | Измерение флуоресценции интеркалирующего красителя или меченого зонда | Позволяет установить наличие или отсутствие специфического продукта; количественная оценка ограничена эффектом плато |
| Флуоресцентная детекция в реальном времени | Ампликон в процессе каждого цикла | Регистрация изменения сигнала в ходе амплификации | Используется для кинетической и количественной оценки, определения Cq/Ct |
| Капиллярный электрофорез с флуоресцентной регистрацией | Фрагменты ДНК, разделенные по длине | Миграция флуоресцентно меченых продуктов в электрическом поле | Особенно важен для анализа STR-профилей и установления генетического профиля человека |
| Электрофорез в агарозном геле | Ампликоны, разделенные по размеру | Движение фрагментов ДНК в электрическом поле с последующей визуализацией | Позволяет оценить размер и наличие продукта, но требует дополнительного этапа разделения |
| Тонкослойная хроматография | Преимущественно низкомолекулярные вещества | Разделение компонентов по сорбции и подвижности в системе растворителей | Не является типичным методом регистрации продуктов ПЦР |
| Микроскопирование | Клеточные и тканевые структуры, крупные частицы | Оптическое наблюдение объекта | Не обеспечивает специфичного выявления амплифицированной последовательности ДНК |
Флуоресцентный сигнал может регистрироваться непосредственно в пробирке или после разделения продуктов, что делает метод совместимым с автоматизированными анализаторами. Интерпретация результата обязательна только при наличии корректных контрольных реакций, исключающих контаминацию и неспецифическую амплификацию. При endpoint-ПЦР положительный сигнал подтверждает факт образования целевого продукта, но сам по себе не всегда отражает исходное количество матричной ДНК. Для судебно-генетических исследований итоговая оценка проводится вместе с данными контрольных образцов и характеристиками применяемых генетических маркеров.