2) необходимы отдельные помещения для экстракции ДНК и приготовления реакций
3) достаточно одной комнаты для всех манипуляций (+)
4) допустимо слияние помещений для экстракции ДНК и приготовления реакций
Неверным является утверждение о достаточности одной комнаты для всех манипуляций. При молекулярно-генетических исследованиях необходимо пространственно или функционально разделять доамплификационные и постамплификационные этапы. В доамплификационной зоне выполняют выделение ДНК и приготовление реакционных смесей, а в постамплификационной — открывают пробирки с ампликонами, проводят электрофорез, гибридизацию или иное исследование продуктов ПЦР.
Ампликоны содержатся в чрезвычайно высокой концентрации и легко распространяются с аэрозолями, перчатками, инструментами и поверхностями. Их перенос в зону выделения ДНК или постановки реакции приводит к контаминации образцов и появлению ложноположительных результатов, смешанных генетических профилей либо воспроизводимых артефактов. Поэтому движение персонала, материалов и оборудования организуют преимущественно в одном направлении — от чистой доамплификационной зоны к постамплификационной, без возврата загрязнённых материалов.
Помещения для экстракции ДНК и приготовления реакций могут объединяться в единый доамплификационный блок, если это допускается нормативными требованиями и обеспечены раздельные рабочие поверхности, оборудование, расходные материалы и регламент уборки. Однако объединение всех этапов в одной комнате недопустимо, поскольку оно устраняет барьер между участками с низкой и высокой концентрацией амплифицированной ДНК. Следовательно, правильный принцип организации — обязательное отделение анализа продуктов амплификации от операций до ПЦР, а не обязательное наличие отдельной комнаты для каждого доамплификационного действия.
| Функциональная зона | Основные операции | Организационное требование | Основной риск |
|---|---|---|---|
| Приём и первичная обработка материала | Регистрация, маркировка, оценка целостности образцов | Контролируемый доступ и исключение контакта с ампликонами | Перепутывание или перекрёстное загрязнение образцов |
| Выделение ДНК | Лизис, очистка и получение нуклеиновой кислоты | Доамплификационная зона; отдельные наборы оборудования и расходных материалов | Перенос ДНК между пробами и ингибирование ПЦР |
| Приготовление реакционных смесей | Дозирование праймеров, зондов, ферментов и контролей | Чистая зона; допускается объединение с экстракцией при разграничении рабочих мест | Контаминация мастер-микса чужой ДНК или ампликоном |
| Амплификация | Проведение ПЦР или другой реакции накопления целевого фрагмента | Закрытые пробирки и минимизация их перемещения после завершения реакции | Образование большого количества потенциально загрязняющих ампликонов |
| Анализ продуктов амплификации | Электрофорез, детекция флуоресценции, секвенирование или иное исследование | Физически изолированная постамплификационная зона | Аэрозольное и контактное распространение ампликонов |
| Потоки персонала и материалов | Перемещение сотрудников, проб, реагентов и отходов | Однонаправленный маршрут от чистых этапов к загрязнённым; отдельные СИЗ | Возврат загрязнения в доамплификационный блок |
Надёжность лабораторного результата обеспечивается не только планировкой, но и строгим соблюдением зонирования, использованием фильтрующих наконечников, выделенного инвентаря и положительных и отрицательных контролей. Регулярный контроль поверхностей и документированная уборка позволяют своевременно выявлять источники контаминации. При подозрении на загрязнение оценивают результаты отрицательных контролей, повторяют исследование из исходного материала и проверяют трассируемость перемещения образцов.