2) очистка препарата ДНК с использованием альтернативных методик (+)
3) глубокая заморозка препарата ДНК
4) повторное выделение ДНК тем же методом
Очистка препарата ДНК альтернативным методом является обоснованной тактикой, поскольку ингибирование полимеразной цепной реакции обычно обусловлено совместным выделением веществ, подавляющих активность ДНК-полимеразы. К таким соединениям относятся гем и его производные, гуминовые кислоты, меланин, индиго, соли, фенол, детергенты, коллагеновые компоненты и ионы кальция. Они могут связываться с матричной ДНК или ферментом, изменять доступность ионов Mg2+, необходимых для катализа, и нарушать флуоресцентную детекцию продуктов амплификации.
Применение другой технологии очистки — например, сорбции на кремнезёмной мембране, магнитных частицах, ультрафильтрации или органической экстракции — изменяет физико-химический механизм разделения компонентов образца. Это позволяет удалить ингибитор, который не был отделён первоначальным способом, и получить ДНК, пригодную для амплификации. Эффективность вмешательства оценивают по восстановлению амплификации внутреннего положительного контроля, нормализации порогового цикла при количественной ПЦР и получению более полного STR-профиля.
Повторный электрофорез с увеличением времени инжекции воздействует только на этап регистрации уже полученных ампликонов и не устраняет подавление самой ПЦР. Глубокая заморозка также не удаляет химические примеси, а многократные циклы замораживания и оттаивания способны дополнительно ухудшать сохранность низкоконцентрированной ДНК. Повторное выделение тем же методом может вновь привести к совместному переносу того же ингибитора, поэтому более рационально использовать методику с иным принципом сорбции, промывки или разделения фаз.
| Подход | Основной принцип | Значение при ингибировании ПЦР |
|---|---|---|
| Очистка на кремнезёмной мембране | Связывание ДНК в присутствии хаотропных солей с последующими промывками | Удаляет значительную часть белков, солей, детергентов и органических примесей |
| Магнитно-сорбционная очистка | Обратимое связывание ДНК с функционализированными магнитными частицами | Позволяет заменить исходный механизм выделения и уменьшить перенос ингибиторов |
| Ультрафильтрация | Разделение веществ по размеру и многократная смена буфера | Снижает концентрацию низкомолекулярных солей, растворителей и других примесей |
| Органическая экстракция | Распределение ДНК, белков и гидрофобных соединений между различными фазами | Может быть эффективна при сложных загрязнённых образцах, но требует строгого удаления остаточного фенола |
| Разведение экстракта | Снижение концентрации ингибитора ниже критического уровня | Применимо при достаточном количестве ДНК; одновременно уменьшает концентрацию матрицы |
| Добавление усилителей ПЦР | Связывание части ингибиторов или стабилизация ферментативной реакции, например с помощью BSA | Дополнительная мера после валидации; не заменяет очистку при выраженном ингибировании |
| Повторная экстракция тем же способом | Воспроизведение первоначального протокола разделения | Малоэффективна, если ингибитор систематически соэлюируется с ДНК |
Ингибирование следует отличать от деградации ДНК и недостаточного количества генетического материала. При ингибировании нарушается амплификация внутреннего положительного контроля, тогда как при низкой концентрации или деградации контрольная матрица обычно амплифицируется нормально. Частичный STR-профиль с преимущественным выпадением длинных локусов может наблюдаться при обоих состояниях, поэтому интерпретация должна учитывать результаты количественной ПЦР и показатели внутреннего контроля. Выбор способа дополнительной очистки проводят с учётом происхождения объекта, предполагаемого ингибитора и риска потери малокопийной ДНК.