2) коллаген
3) меланин
4) гематин (+)
Гематин представляет собой окисленное производное гема, образующееся из гемоглобина и сохраняющееся в высохшем кровяном пятне. При выделении ДНК он может переходить в экстракт вместе с нуклеиновыми кислотами либо оставаться связанным с ними. Для полимеразной цепной реакции гематин является значимым ингибитором, поэтому его присутствие объясняет снижение эффективности амплификации ДНК из сухой крови.
Основной механизм связан с непосредственным взаимодействием гематина с термостабильной ДНК-полимеразой и комплексом матрица—праймер , вследствие чего нарушаются присоединение праймера и элонгация цепи. Ингибирующий эффект зависит от концентрации пигмента и может усиливаться при недостаточной очистке экстракта. В ПЦР в реальном времени это проявляется увеличением значения Cq или полным отсутствием сигнала, а при судебно-генетическом исследовании может привести к выпадению отдельных аллелей и ложноотрицательному результату.
Для подтверждения ингибирования используют внутренний контроль амплификации: если контрольная реакция также не дает ожидаемого сигнала, отрицательный результат нельзя считать доказательством отсутствия ДНК. Устранение эффекта достигается дополнительной очисткой экстракта, удалением гемсодержащих примесей, разведением образца или применением условий реакции, повышающих устойчивость полимеразы к ингибиторам.
| Компонент или группа | Типичный источник | Механизм влияния на ПЦР | Лабораторная тактика |
|---|---|---|---|
| Гематин | Высохшая кровь, продукты окисления гема | Связывание с полимеразой и/или матрицей, снижение эффективности элонгации; эффект зависит от концентрации | Повторная очистка, промывка, контролируемое разведение, использование внутреннего контроля |
| Гемоглобин и другие гемсодержащие соединения | Свежая или деградировавшая кровь | Неспецифическое подавление активности ДНК-полимеразы и нарушение взаимодействия фермента с матрицей | Удаление белково-пигментной фракции при экстракции ДНК |
| Мочевина | Моча, загрязнение образца, остатки денатурирующих реагентов | При высокой концентрации нарушает структуру белков и снижает активность фермента; не является характерным компонентом сухой крови | Удаление остаточного реагента или разведение экстракта |
| Коллаген | Соединительная ткань, кожные и тканевые фрагменты | Не относится к классическим прямым ингибиторам ПЦР; может затруднять высвобождение и очистку ДНК при совместной экстракции | Эффективное разрушение тканевого материала и очистка нуклеиновых кислот |
| Меланин | Пигментированные ткани, волосы, кожа | Связывает нуклеиновые кислоты и компоненты ферментной системы, подавляя амплификацию | Специализированная очистка и оценка внутреннего контроля амплификации |
| ЭДТА | Кровь, собранная с антикоагулянтом | Хелатирует ионы Mg2+, необходимые для каталитической активности ДНК-полимеразы | Контроль переноса антикоагулянта, очистка экстракта, осторожная оптимизация концентрации MgCl2 |
Выбор гематина как правильного ответа обусловлен его непосредственной связью с кровью и доказанной способностью подавлять ПЦР. Высушивание образца не устраняет гемсодержащие ингибиторы, а иногда способствует их концентрации в остатке материала. Отрицательный результат при наличии признаков ингибирования требует повторного исследования после очистки экстракта, а не интерпретации как окончательного отсутствия генетического материала.