2) 4
3) 32
4) 1024
За один идеальный цикл полимеразной цепной реакции количество молекул целевого участка ДНК увеличивается в 2 раза. Это связано с тем, что каждая двухцепочечная молекула после денатурации разделяется на две одноцепочечные матрицы, на каждой из которых при участии праймеров и термостабильной ДНК-полимеразы синтезируется комплементарная цепь. В результате из одной исходной молекулы образуются две идентичные двухцепочечные молекулы.
Амплификация носит экспоненциальный характер и в идеальных условиях описывается формулой N = N0 × 2n, где N0 — исходное число копий ДНК, а n — количество циклов. Поэтому увеличение в 4, 32 и 1024 раза соответствует не одному, а соответственно двум, пяти и десяти циклам. В реальной ПЦР эффективность может быть ниже 100% из-за недостатка реагентов, присутствия ингибиторов, неоптимального отжига праймеров и постепенного выхода реакции на плато.
| Этап или число циклов | Количество копий при N0 = 1 | Краткая характеристика |
|---|---|---|
| Исходная матрица | 1 | Одна двухцепочечная молекула целевой ДНК до начала амплификации |
| 1 цикл | 2 | Каждая исходная молекула служит матрицей для образования двух копий |
| 2 цикла | 4 | Происходит повторное удвоение продуктов первого цикла |
| 5 циклов | 32 | Количество продукта соответствует 25 |
| 10 циклов | 1024 | Количество продукта соответствует 210 |
| Экспоненциальная фаза | Близко к 2n | Амплификация наиболее эффективна, концентрация реагентов не ограничивает реакцию |
| Фаза плато | Меньше расчётного значения | Скорость накопления продукта снижается из-за истощения компонентов и накопления побочных продуктов |
Последовательность одного цикла включает денатурацию ДНК, отжиг праймеров и элонгацию новых цепей. Специфичность реакции определяется комплементарностью праймеров выбранному участку генома, а чувствительность — эффективностью амплификации и качеством выделенной нуклеиновой кислоты. В ПЦР в реальном времени накопление ампликона оценивают по флуоресцентному сигналу, а пороговый цикл используют для косвенной количественной оценки исходной концентрации мишени. Чем больше исходных копий ДНК содержится в образце, тем раньше регистрируется превышение порогового уровня флуоресценции.