2) секвенированиея (+)
3) электронной микроскопии
4) ИФА
Секвенирование является методом непосредственного изучения генетического разнообразия вируса бешенства, поскольку позволяет определить последовательность нуклеотидов его РНК. Вирус бешенства относится к РНК-содержащим вирусам с одноцепочечным негативным геномом; поэтому перед секвенированием обычно выполняют обратную транскрипцию и амплификацию целевого участка методом ОТ-ПЦР. Анализ полученной последовательности выявляет мутации, генетические линии и варианты вируса.
Сравнение нуклеотидных последовательностей с референсными геномами и построение филогенетических деревьев позволяют установить генотиповую принадлежность изолята, оценить его родство с циркулирующими штаммами и проследить возможный источник заноса. Для эпидемиологического надзора могут исследоваться гены нуклеопротеина, гликопротеина и другие участки генома, а наиболее детальную информацию обеспечивает полногеномное секвенирование.
Методы флуоресцирующих антител и иммуноферментный анализ выявляют антиген вируса либо антитела к нему, но не определяют порядок нуклеотидов. Электронная микроскопия характеризует морфологию вирусных частиц и также не позволяет оценить их генетические различия. Поэтому именно секвенирование соответствует задаче генотипирования и изучения молекулярной эволюции возбудителя.
| Метод | Исследуемый объект | Основной результат | Возможность оценки генетического разнообразия |
|---|---|---|---|
| Секвенирование | Нуклеотидная последовательность вирусной РНК или амплифицированного фрагмента | Выявление мутаций, генотипирование, филогенетический анализ | Высокая; метод непосредственно характеризует генетические различия |
| ОТ-ПЦР | Специфический участок генома после обратной транскрипции | Обнаружение РНК вируса и амплификация фрагмента | Ограниченная без последующего секвенирования; преимущественно качественная диагностика |
| Метод флуоресцирующих антител | Вирусный антиген в исследуемом материале | Подтверждение присутствия антигена вируса бешенства | Не позволяет установить нуклеотидные различия между изолятами |
| ИФА | Антиген вируса или специфические антитела в образце | Серологическое или антигенное выявление инфекции | Генетическую структуру и генотип вируса не определяет |
| Электронная микроскопия | Морфология вирусных частиц | Визуализация вирионов и оценка их формы | Недостаточная; морфологическое сходство не отражает генетическую вариабельность |
| Филогенетический анализ | Набор нуклеотидных последовательностей изолятов | Определение родства, линий происхождения и путей распространения | Высокая, но зависит от качества исходного секвенирования и базы сравнения |
Результаты секвенирования особенно важны при молекулярно-эпидемиологическом расследовании случаев бешенства у человека и животных. Они помогают различать варианты, связанные с разными резервуарами инфекции, включая природные и синантропные популяции. Генетические данные дополняют стандартное лабораторное подтверждение, но интерпретируются совместно с эпидемиологическим анамнезом и результатами выявления вирусного антигена или РНК.