2) гена 16S рРНК (+)
3) Митохрндриальных генов
4) гена rpoB
Первые универсальные схемы молекулярной идентификации и типирования бактерий основывались на амплификации и последующем секвенировании гена 16S рРНК. Этот ген кодирует компонент малой субъединицы рибосомы и присутствует у большинства бактерий, поэтому его можно исследовать с помощью консервативных праймеров, подходящих для широкого круга микроорганизмов. Одновременно в его последовательности имеются вариабельные участки, накопившие видоспецифичные нуклеотидные замены.
После ПЦР-амплификации фрагмента 16S рРНК обычно выполняли секвенирование по Сэнгеру и сравнивали полученную последовательность с референсными базами данных. Степень сходства и филогенетическое положение изолята позволяли определить его род, вид или близкородственную группу. Универсальность праймеров, консервативная структура гена и наличие вариабельных регионов сделали 16S рРНК базовым молекулярным маркером ранних бактериологических методов.
Гены recA и rpoB также применяются для идентификации бактерий, однако чаще используются как дополнительные или более дискриминирующие маркеры при близком родстве изолятов. Митохондриальные гены характерны преимущественно для эукариот и не являлись универсальной основой раннего бактериального типирования.
| Маркер или подход | Биологическая основа | Основное диагностическое применение | Преимущество | Ограничение |
|---|---|---|---|---|
| 16S рРНК | Ген субъединицы бактериальной рибосомы с консервативными и вариабельными участками | Универсальная идентификация бактерий и филогенетическая классификация | Широкая применимость и наличие универсальных праймеров | Недостаточная разрешающая способность для некоторых близкородственных видов и штаммов |
| recA | Ген белка, участвующего в рекомбинации и репарации ДНК | Уточнение видовой принадлежности и дифференциация близких таксонов | Нередко более высокая вариабельность, чем у 16S рРНК | Не является универсальным первичным маркером для всех бактериальных групп |
| rpoB | Ген β-субъединицы бактериальной РНК-полимеразы | Видовая идентификация, филогенетический анализ, иногда оценка устойчивости к рифампицину | Высокая дискриминирующая способность благодаря большей вариабельности | Требует группоспецифических праймеров и сопоставимых референсных последовательностей |
| Митохондриальные гены | Геном органелл эукариотических клеток | Бар-кодирование и типирование животных, грибов и других эукариот | Многочисленные копии в клетке и удобство амплификации | Не являются универсальным маркером бактериальных изолятов |
| ПЦР с последующим секвенированием | Избирательное копирование нужного участка ДНК с определением его нуклеотидной последовательности | Молекулярная идентификация возбудителя при наличии или отсутствии культивирования | Специфичность, воспроизводимость и возможность работы с небольшим количеством материала | Результат зависит от качества ДНК, праймеров и полноты баз данных |
| Мультилокусное секвенирование | Одновременный анализ нескольких генов домашнего хозяйства | Штаммовая дифференциация и эпидемиологическое расследование | Более высокая разрешающая способность, чем у одного локуса | Сложнее, дороже и менее удобно для первичной универсальной идентификации |
Таким образом, правильный выбор определяется исторической ролью 16S рРНК как универсального бактериального филогенетического маркера. Результаты секвенирования интерпретируют с учетом порогов сходства, качества хроматограммы и таксономической полноты базы данных. При необходимости различать виды с почти идентичными последовательностями 16S рРНК используют дополнительные локусы, мультилокусное типирование или полногеномное секвенирование. Для эпидемиологического типирования штаммов одного анализа 16S рРНК обычно недостаточно.