2) синтетические олигонуклеотиды (+)
3) цельные вирусные геномы
4) фрагменты нуклеиновых кислот, полученные генно-инженерными методами
Праймеры в полимеразной цепной реакции представляют собой короткие синтетические одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК, обычно длиной около 18–30 нуклеотидов. Их последовательность комплементарна участкам матричной нуклеиновой кислоты, расположенным по разные стороны от амплифицируемого фрагмента. В реакции используются два праймера: прямой и обратный, что обеспечивает ограниченное и экспоненциальное копирование целевого участка.
Праймер присоединяется к матрице по принципу комплементарности и предоставляет свободную 3′-гидроксильную группу, от которой ДНК-полимераза начинает синтез новой цепи. Специфичность ПЦР определяется прежде всего соответствием праймеров генетической мишени; ошибки подбора, значительная вторичная структура или образование праймер-димеров могут снижать чувствительность и приводить к неспецифической амплификации. При исследовании РНК-содержащих вирусов перед ПЦР проводят обратную транскрипцию, в результате которой получают комплементарную ДНК.
Пептиды не участвуют в качестве затравок для синтеза ДНК, а цельный вирусный геном служит лишь исходной матрицей, если он присутствует в образце. Фрагменты нуклеиновых кислот, полученные генно-инженерными методами, могут применяться как контрольные или калибровочные материалы, но не являются стандартной природой праймера. Таким образом, химически синтезированные олигонуклеотиды обеспечивают направленное начало репликации и избирательное выявление заданного участка генома.
| Компонент или признак | Молекулярная характеристика | Функция в исследовании |
|---|---|---|
| Прямой праймер | Одноцепочечный ДНК-олигонуклеотид, комплементарный участку одной цепи матрицы | Инициирует синтез новой цепи в направлении к целевому фрагменту |
| Обратный праймер | Олигонуклеотид, комплементарный противоположной цепи в другом фланкирующем участке | Определяет вторую границу ампликона и обеспечивает экспоненциальное накопление продукта |
| Матрица | ДНК или кДНК; при исследовании РНК-вирусов исходной молекулой является РНК | Содержит участок генома, который должен быть амплифицирован и обнаружен |
| Термостабильная ДНК-полимераза | Фермент, сохраняющий активность после циклов денатурации | Удлиняет праймер, присоединяя дезоксирибонуклеотиды к его 3′-концу |
| Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты | dATP, dCTP, dGTP и dTTP — субстраты синтеза ДНК | Используются для построения комплементарной цепи ампликона |
| Флуоресцентный зонд в ПЦР-РВ | Отдельный меченый олигонуклеотид, комплементарный внутреннему участку ампликона | Повышает специфичность детекции и позволяет количественно оценивать накопление продукта |
| Контроль амплификации | Положительный контроль содержит известную мишень, отрицательный — не содержит целевой последовательности | Позволяет отличить истинный отрицательный результат от ингибирования реакции или контаминации |
Качество праймеров оценивают по специфичности, сходной температуре плавления, отсутствию выраженной комплементарности между ними и низкому риску образования вторичных структур. Генетическая вариабельность вируса в области связывания может препятствовать отжигу праймера и вызывать ложноотрицательный результат. Поэтому в диагностических наборах часто используют несколько мишеней, расположенных в консервативных участках генома. Интерпретация результата всегда должна учитывать наличие внутренних контролей и клинико-эпидемиологические данные.