2) обнаружении ионов водорода, которые выделяются во время полимеризации днк
3) детекции красителей, возбуждаемых излучением аргонового лазера (+)
4) масс-спектрометрии
Капиллярные секвенаторы классического типа реализуют метод циклического секвенирования по Сэнгеру с детекцией продуктов методом лазер-индуцированной флуоресценции. В реакцию включают флуоресцентно меченные дидезоксинуклеотиды, каждый тип которых соответствует определённому основанию. После синтеза фрагменты ДНК различной длины разделяются капиллярным электрофорезом, а при прохождении зоны регистрации возбуждаются лазерным излучением, традиционно аргоновым лазером.
Возникающее флуоресцентное излучение регистрируется оптической системой и по спектральным характеристикам позволяет определить терминальный нуклеотид каждого фрагмента. Последовательность сигналов преобразуется в электрофореграмму, или хроматограмму секвенирования, по которой устанавливают порядок нуклеотидов и выявляют замены, небольшие делеции и вставки. Поэтому отмеченный вариант отражает основной принцип детекции в капиллярных секвенаторах.
Обнаружение ионов водорода связано преимущественно с ион-чувствительным секвенированием, где регистрируется изменение pH при включении нуклеотида в растущую цепь. Хемилюминесцентный сигнал характерен для пиросеквенирования, а масс-спектрометрия определяет отношение массы к заряду молекулярных ионов и не является стандартным способом регистрации продуктов в капиллярном электрофорезе.
| Метод или платформа | Регистрируемый сигнал | Физико-химическая основа | Основной результат |
|---|---|---|---|
| Капиллярное секвенирование по Сэнгеру | Флуоресценция меченых фрагментов | Лазерное возбуждение красителей после разделения фрагментов по длине | Электрофореграмма с последовательностью нуклеотидов |
| Пиросеквенирование | Хемилюминесценция | Высвобождение пирофосфата, образование АТФ и свечение в люциферазной реакции | Определение включения нуклеотида по интенсивности сигнала |
| Ион-полупроводниковое секвенирование | Изменение концентрации ионов водорода | Локальное снижение pH при полимеризации ДНК на сенсорной поверхности | Регистрация включения нуклеотида без флуоресцентной метки |
| Масс-спектрометрическое определение | Ионный ток и спектр масс | Разделение ионов по отношению массы к заряду | Идентификация молекул или продуктов реакции по молекулярной массе |
| Флуоресцентный краситель | Свет с определённым спектром эмиссии | Возбуждение лазером и последующая регистрация излучения детектором | Различение четырёх типов терминальных нуклеотидов |
| Капиллярный электрофорез | Время выхода фрагмента и интенсивность сигнала | Разделение заряженных фрагментов ДНК в электрическом поле по размеру | Определение длины фрагмента и последовательности оснований |
Таким образом, ключевым диагностическим принципом капиллярного секвенирования является сочетание электрофоретического разделения и лазерной флуоресцентной детекции. Флуорофоры могут возбуждаться аргоновым лазером или иными лазерными источниками в зависимости от модели прибора, однако физическая сущность метода сохраняется. Достоверность чтения последовательности оценивают по форме и высоте пиков, качеству электрофореграммы и согласованности сигнала с референсной последовательностью.