2) накопление чистой культуры
3) идентификацию чистой культуры (+)
4) определение чувствительности к антибиотикам
На третьем этапе бактериологического исследования проводят идентификацию выделенной чистой культуры, то есть устанавливают её родовую и видовую принадлежность. Для коклюша это прежде всего распознавание Bordetella pertussis с использованием совокупности культуральных, морфологических, тинкториальных, биохимических и серологических признаков. К этому моменту микроорганизм уже выделен на селективной среде и получен в виде изолированной культуры, поэтому повторный посев и накопление биомассы относятся к предшествующим этапам.
Bordetella pertussis — мелкая грамотрицательная неподвижная коккобацилла, аэроб, характеризующийся слабой биохимической активностью. Для идентификации оценивают типичные колонии на средах Борде—Жангу или Ригана—Лоу, результаты окраски по Граму, оксидазную и каталазную реакции, отсутствие уреазной активности, а также реакцию агглютинации со специфическими диагностическими сыворотками. В современных лабораториях видовая принадлежность может подтверждаться методом MALDI-TOF масс-спектрометрии или видоспецифической ПЦР, однако это также относится к идентификационному этапу.
Определение чувствительности к антибиотикам не является содержанием третьего этапа выделения возбудителя: его выполняют после видовой идентификации при наличии клинических показаний и технической возможности. Для дифференциации близких представителей рода Bordetella особенно важны биохимические свойства, серологический профиль и молекулярные маркеры, поскольку культуральные признаки могут частично совпадать.
| Этап исследования | Основная цель | Ключевые методы или признаки | Результат |
|---|---|---|---|
| Первичный посев | Выделить возбудителя из клинического материала | Посев отделяемого носоглотки на селективные среды Борде—Жангу или Ригана—Лоу | Рост подозрительных колоний |
| Получение чистой культуры | Отделить предполагаемый возбудитель от сопутствующей микрофлоры | Пересеивание изолированной колонии, контроль однородности роста | Изолят, пригодный для дальнейшего изучения |
| Морфологическая характеристика | Оценить соответствие культуры предполагаемой группе микроорганизмов | Мелкие грамотрицательные коккобациллы, неподвижность | Предварительное предположение о принадлежности к Bordetella |
| Культуральные свойства | Подтвердить типичный фенотип возбудителя | Медленный рост на специальных средах, характерные гладкие блестящие колонии | Культуральное подтверждение подозрения на B. pertussis |
| Биохимическая идентификация | Разграничить близкие виды | Оксидазная и каталазная реакции, отсутствие уреазы и выраженной ферментативной активности | Видовая дифференциация в комплексе с другими тестами |
| Серологическая или инструментальная верификация | Окончательно подтвердить видовую принадлежность | Агглютинация со специфическими сыворотками, MALDI-TOF или видоспецифическая ПЦР | Идентифицированная чистая культура B. pertussis |
| Антимикробная чувствительность | Оценить возможность терапии выделенного изолята | Диско-диффузионный метод, градиентные тесты или определение МПК по показаниям | Дополнительная характеристика, выполняемая после идентификации |
Таким образом, правильный ответ связан с установлением видовой принадлежности уже выделенной чистой культуры. Идентификация основывается не на одном тесте, а на сочетании фенотипических и, при необходимости, молекулярных признаков. Для подтверждения коклюшной инфекции важно отличать B. pertussis от B. parapertussis и других сходных микроорганизмов. Только после этого результаты исследования могут быть корректно интерпретированы и использованы для дальнейшей клинической тактики.