2) использованием эффекта интерференции света (+)
3) различием РН компартментов клетки
4) использованием эффекта изменения диэлектрической проницаемости
Повышение возможностей фазово-контрастной микроскопии основано на использовании интерференции света. Прозрачные клетки микроорганизмов и их структуры изменяют фазу проходящей световой волны вследствие различий в толщине и показателе преломления, но почти не изменяют её интенсивность, поэтому в обычном светлом поле могут оставаться малоконтрастными. В фазово-контрастной системе кольцевая диафрагма и фазовая пластинка разделяют прямой и дифрагированный свет, после чего их интерференция преобразует невидимые глазом фазовые сдвиги в различия яркости.
Такой принцип позволяет наблюдать живые неокрашенные бактерии, их размеры, форму, включения, деление и подвижность без фиксации и окрашивания. В строгом физическом смысле фазово-контрастный метод не изменяет предел разрешения, который определяется длиной волны света и числовой апертурой объектива, а повышает контрастность и выявляемость мелких прозрачных объектов, создавая практический эффект улучшения разрешающей способности. Наличие спор или различие pH клеточных компартментов может влиять на оптические свойства объекта, но не является механизмом работы метода; изменение диэлектрической проницаемости связано с оптическими характеристиками среды косвенно.
| Метод микроскопии | Основной физический принцип | Особенности изображения | Применение в бактериологии |
|---|---|---|---|
| Светлопольная | Регистрация прямого света, прошедшего через препарат | Низкий контраст у прозрачных неокрашенных клеток | Окрашенные мазки, оценка формы, расположения и тинкториальных свойств |
| Фазово-контрастная | Интерференция прямого и дифрагированного света после преобразования фазовых сдвигов | Контрастное изображение живых неокрашенных клеток; возможны светлые или тёмные ореолы | Наблюдение морфологии, деления и подвижности бактерий в нативном материале |
| Тёмнопольная | В объектив попадает преимущественно боковой, рассеянный объектом свет | Светлые объекты на тёмном фоне | Выявление тонких и слабоконтрастных микроорганизмов, включая спирохеты |
| Дифференциально-интерференционная (DIC) | Интерференция поляризованных лучей, прошедших через соседние участки объекта | Рельефное псевдообъёмное изображение с высокой детализацией границ | Исследование тонких клеточных структур и динамики живых клеток |
| Флуоресцентная | Регистрация света, испускаемого флуорофорами после возбуждения | Яркие специфически меченные структуры на тёмном фоне | Экспресс-выявление антигенов, токсинов и отдельных групп микроорганизмов |
| Электронная | Формирование изображения пучком электронов с использованием электромагнитных линз | Значительно более высокое пространственное разрешение, но необходима специальная подготовка образца | Изучение ультраструктуры бактерий, оболочек, жгутиков и вирусных частиц |
Фазово-контрастное изображение особенно информативно при исследовании нативных препаратов, когда окрашивание может нарушить жизнеспособность или движение клеток. Диагностическое заключение по одному такому изображению обычно ограничивают морфологическими признаками и дополняют культуральными, биохимическими или молекулярными методами. При интерпретации следует учитывать характерные ореолы и артефакты, возникающие при неправильной настройке кольцевой диафрагмы или фазовой пластинки.