2) 5
3) 30
4) 45
При глубинном посеве расплавленную питательную среду необходимо внести в чашку Петри не позднее чем через 15 минут после внесения исследуемого материала. Такой временной интервал предусмотрен стандартной техникой глубинного посева и необходим для сохранения равномерного распределения микроорганизмов в объёме среды; чрезмерная задержка может способствовать агрегации клеток и, соответственно, образованию колоний не из отдельных жизнеспособных единиц. В стандартизованных методиках подсчёта микроорганизмов для pour plate technique также указывается предел 15 минут между внесением образца и добавлением расплавленного агара.
После добавления агара чашку осторожно перемешивают вращательными движениями, обеспечивая равномерное распределение инокулята, а затем дают среде застыть. Расплавленный агар предварительно охлаждают примерно до 44–47 °C: при более высокой температуре возможно термическое повреждение чувствительных микроорганизмов, а чрезмерное охлаждение приводит к преждевременному гелеобразованию и ухудшению смешивания. При правильном выполнении метода колонии формируются как в толще агара, так и на его поверхности, что позволяет количественно определять число жизнеспособных микроорганизмов в исследуемом материале.
| Этап глубинного посева | Критическое условие | Практическое значение |
|---|---|---|
| Внесение материала | Определённый объём образца или его разведения помещают в стерильную чашку | Обеспечивает возможность количественного учёта КОЕ |
| Добавление среды | Не позднее 15 минут после внесения материала | Снижает риск агрегации микроорганизмов и искажения результата |
| Температура агара | Обычно около 44–47 °C | Сохраняет текучесть среды и уменьшает вероятность термического повреждения клеток |
| Перемешивание | Осторожные вращательные движения чашки | Равномерно распределяет микроорганизмы по объёму агара |
| Застывание среды | Чашку оставляют до полного гелеобразования | Фиксирует клетки в различных слоях питательной среды |
| Рост микроорганизмов | Колонии развиваются в толще и на поверхности агара | Позволяет учитывать жизнеспособные клетки и рассчитывать концентрацию КОЕ |
Глубинный посев особенно важен при количественном микробиологическом исследовании жидких образцов и их разведений. Его аналитическая точность зависит не только от правильного разведения материала, но и от строгого соблюдения времени заливки, температуры среды и техники перемешивания. Нарушение этих условий способно изменить число обнаруживаемых колониеобразующих единиц и снизить воспроизводимость исследования. Поэтому интервал до 15 минут рассматривается как технологически значимый предел выполнения метода.