2) применяются только при криоконсервации
3) применяются вне инкубатора
4) применяются в СО2-инкубаторе (+)
Среды на основе бикарбонатного буфера поддерживают физиологический pH только при наличии контролируемой атмосферы углекислого газа, поэтому их используют в СО2-инкубаторе. Буферная система основана на равновесии: CO2 + H2O ⇄ H2CO3 ⇄ H+ + HCO3−. При заданной концентрации бикарбоната содержание CO2 определяет концентрацию водородных ионов и, следовательно, pH культуральной среды; обычно поддерживают слабощелочной физиологический диапазон около 7,2–7,4.
При вынесении открытой бикарбонатной среды из инкубатора CO2 быстро удаляется в атмосферу, равновесие смещается в сторону уменьшения концентрации угольной кислоты, а pH повышается. Такая алкалинизация может нарушать метаболизм гамет и эмбрионов, процессы оплодотворения, функционирование веретена деления и раннее эмбриональное развитие. Поэтому среду предварительно уравновешивают в газовой фазе инкубатора, а манипуляции вне него проводят кратковременно либо используют специальные буферы, устойчивые к атмосферному воздуху.
| Тип среды или условие | Основной буфер | Требования к газовой фазе | Типичное применение | Риск нарушения pH |
|---|---|---|---|---|
| Среда для длительного культивирования эмбрионов | Бикарбонат | Контролируемая концентрация CO2 в инкубаторе | Культура от зиготы до стадии бластоцисты | Высокий при длительном нахождении вне инкубатора |
| Бикарбонатная среда после уравновешивания | Бикарбонат/CO2 | Стабильная газовая среда и температура | Рутинное культивирование в закрытой системе | Минимальный при соблюдении протокола |
| Бикарбонатная среда в открытой чашке вне инкубатора | Бикарбонат | Контакт с атмосферным воздухом | Нежелательный режим, допустимый только кратковременно | Быстрое повышение pH вследствие потери CO2 |
| Среда для микроманипуляций | HEPES | Не требует постоянной атмосферы CO2 | ИКСИ, перенос клеток, кратковременная оценка гамет и эмбрионов | Ниже при работе вне инкубатора, но длительное воздействие также нежелательно |
| Среда для работы при комнатной атмосфере | MOPS или другой биологический аминный буфер | Может использоваться без CO2 в течение ограниченного времени | Краткие лабораторные манипуляции | Зависит от температуры, времени экспозиции и концентрации буфера |
| Микрокапля среды под минеральным маслом | Чаще бикарбонат | Требуется предварительное уравновешивание в CO2-инкубаторе | Культивирование эмбрионов в малом объёме | Масло уменьшает газообмен, но не заменяет правильную CO2-атмосферу |
Таким образом, применение бикарбонатных сред связано не только с их химическим составом, но и с обязательным контролем газовой среды, температуры и времени экспозиции. Нестабильность pH часто возникает при частом открывании инкубатора, недостаточном времени предварительного уравновешивания или использовании среды вне CO2-атмосферы. Для кратковременной работы на рабочем столе выбирают HEPES- или MOPS-содержащие среды, а для длительного культивирования возвращают гаметы и эмбрионы в уравновешенную бикарбонатную среду.