2) осуществляется по стандартному протоколу (+)
3) не осуществляется, т.к. морулы не могут пережить процедуру криоконсервации
4) должна осуществляться после появления полости в моруле
Витрификация морулы осуществляется по стандартному протоколу криоконсервации эмбрионов. Морулой называют эмбриональную стадию, обычно соответствующую 4-м суткам развития, при которой происходит компактизация бластомеров, но полость бластоцеля еще отсутствует. На этой стадии эмбрион уже может быть помещен в растворы криопротекторов и подвергнут ультрабыстрому охлаждению; наличие полости не является условием сохранения жизнеспособности.
Стандартная витрификация включает кратковременную экспозицию в растворе для эквилибрации, затем перенос в раствор с высокой концентрацией проникающих и непроникающих криопротекторов, загрузку в носитель с минимальным объемом среды и быстрое погружение в жидкий азот. Такое сочетание обеспечивает стеклообразное состояние раствора без образования внутриклеточных кристаллов льда, которые повреждают мембраны и органеллы. Конкретный состав растворов и длительность экспозиции определяются валидированным набором и лабораторным стандартом, но специальное предварительное культивирование в среде без Ca2+ и Mg2+ не является обязательным этапом.
Морула способна пережить витрификацию и последующее отогревание; после размораживания оценивают сохранность клеток, целостность эмбриона, восстановление компактизации и продолжение развития до бластоцисты. Отсутствие полости не препятствует криоконсервации: необходимость оценки расширения или коллапса бластоцеля относится преимущественно к бластоцистам. Таким образом, витрификация морулы проводится до формирования полости, если эмбрион соответствует критериям качества и протоколу конкретной эмбриологической лаборатории.
| Критерий | Морула | Бластоциста |
|---|---|---|
| Основной морфологический признак | Компактизация бластомеров, четкая межклеточная граница может отсутствовать | Наличие бластоцеля, внутренней клеточной массы и трофэктодермы |
| Возможность витрификации | Выполняется; стадия является допустимой для криоконсервации | Выполняется, включая раннюю и расширенную бластоцисту |
| Принцип метода | Эквилибрация, концентрированный раствор криопротекторов, минимальный объем и ультрабыстрое охлаждение | Тот же принцип; для расширенной бластоцисты может потребоваться уменьшение объема бластоцеля |
| Необходимость среды без Ca2+ и Mg2+ | Рутинно не требуется; используется только при наличии специального показания и валидированного протокола | Не является универсальным обязательным этапом |
| Требование наличия полости | Не требуется; витрификация проводится до формирования бластоцеля | Полость является диагностическим признаком стадии, но не единственным условием криоконсервации |
| Оценка после отогревания | Сохранность клеток, целостность и продолжение компактизации или развития | Сохранность внутренней клеточной массы и трофэктодермы, восстановление или расширение бластоцеля |
| Главный фактор повреждения | Образование внутриклеточного льда при недостаточной скорости охлаждения или нарушении экспозиции | Ледообразование, осмотический стресс и повреждение клеток трофэктодермы при неправильном отогревании |
Успех процедуры определяется не только стадией развития, но и качеством эмбриона, соблюдением времени экспозиции и корректностью отогревания. Для морулы особенно важно обеспечить равномерный контакт с криопротектором при сохранении минимального объема среды. После отогревания дальнейшее развитие эмбриона является более информативным критерием жизнеспособности, чем наличие полости непосредственно до витрификации.