2) секвенирование по Сенгеру
3) тест быстрого торможения фокуса флюоресценции
4) биопробу на белых мышах, заражение культуры клеток мышиной нейробластомы (+)
К методам выделения вируса бешенства относят биологическую пробу на белых мышах и заражение восприимчивой клеточной культуры мышиной нейробластомы. Исследуемый материал, обычно фрагменты головного мозга или другие образцы от животного, вводят лабораторным животным либо инокулируют в культуру клеток. При наличии жизнеспособного вируса происходит его репликация; выделение подтверждают выявлением рабического антигена или вирусной РНК. Такой подход демонстрирует именно инфекционность возбудителя, а не только наличие его отдельных компонентов.
Вирус бешенства относится к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae и обладает выраженным нейротропизмом, поэтому нейробластомные клеточные линии и мозговая ткань являются чувствительными системами для его размножения. Биопроба на мышах представляет собой классический способ изоляции вируса, однако из-за длительности, трудоёмкости и требований биологической безопасности в современной практике преимущественно применяются клеточные культуры и молекулярные методы.
ИФА выявляет антиген вируса либо специфические антитела, тест быстрого торможения фокуса флюоресценции оценивает вируснейтрализующие антитела, а секвенирование по Сенгеру определяет последовательность нуклеотидов вирусного генома. Эти методы важны для диагностики, серологической оценки и генетической характеристики возбудителя, но сами по себе не обеспечивают его выделения в живом виде. Поэтому правильным является вариант, включающий заражение белых мышей и культуры клеток мышиной нейробластомы.
| Метод | Исследуемый объект | Что показывает | Относится ли к выделению возбудителя |
|---|---|---|---|
| Биопроба на белых мышах | Инокулированный биологический материал | Размножение инфекционного вируса и развитие специфического поражения нервной системы | Да; классический биологический метод изоляции |
| Заражение культуры клеток мышиной нейробластомы | Живая восприимчивая клеточная культура | Репликация вируса с последующим обнаружением антигена или вирусной РНК | Да; культуральный метод выделения вируса |
| ИФА (ELISA) | Антиген вируса или антитела сыворотки | Наличие рабического антигена либо иммунного ответа | Нет; метод иммунологической детекции |
| Тест быстрого торможения фокуса флюоресценции | Сыворотка пациента или животного | Титр вируснейтрализующих антител, способных подавлять инфекцию в культуре клеток | Нет; метод серологической оценки |
| Секвенирование по Сенгеру | Амплифицированный фрагмент вирусной РНК после обратной транскрипции | Нуклеотидная последовательность, генетическая принадлежность и возможная линия вируса | Нет; молекулярно-генетическая идентификация |
| Прямая реакция иммунофлюоресценции | Отпечатки или срезы ткани головного мозга | Специфические антигенсодержащие включения вируса | Нет; экспресс-обнаружение антигена в материале |
Критерием выделения возбудителя является получение инфекционного вируса, способного реплицироваться в организме экспериментального животного или в чувствительной клеточной культуре. Подтверждение изолята проводят иммунологическими и молекулярными методами. На практике для посмертной диагностики чаще используют обнаружение антигена в мозговой ткани и выявление вирусной РНК, поскольку эти методы быстрее и безопаснее. Биологическая проба сохраняет значение как классический референсный способ доказательства инфекционности материала.