2) кислоты серной раствор 20%
3) раствор алюминия хлорида
4) реакцию азосочетания (+)
Кумарины — производные бензо-α-пирона, содержащие сопряжённую лактонную систему, которая определяет их хроматографические и спектральные свойства. На тонкослойной хроматограмме их обнаруживают реакцией азосочетания: после обработки пластинки диазотированным ароматическим амином в щелочной среде образуются окрашенные азосоединения. В результате зоны, содержащие кумарины, приобретают жёлтую, оранжевую, красную или розовую окраску, интенсивность которой зависит от строения вещества и наличия активированных положений или фенольных гидроксильных групп.
Механизм реакции связан с электрофильным присоединением диазониевого катиона к электронно-обогащённому ароматическому фрагменту молекулы кумарина. Фенольные кумарины, например умбеллиферон и эскулетин, реагируют особенно заметно благодаря повышенной электронной плотности, создаваемой гидроксильными группами; образующиеся азокрасители служат аналитическим маркером присутствия соединений этой группы. Поэтому именно реакция азосочетания рассматривается как характерный способ проявления кумаринов после разделения экстракта на хроматограмме.
Другие предложенные реагенты могут давать неспецифическое окрашивание либо применяются преимущественно для выявления иных классов биологически активных веществ. Раствор хлорида алюминия используют главным образом для обнаружения флавоноидов по образованию хелатных комплексов и изменению флуоресценции, а раствор Люголя выявляет широкий круг ненасыщенных и адсорбирующих соединений без достаточной групповой специфичности. Разбавленная серная кислота также может изменять окраску или флуоресценцию различных веществ, но не является наиболее характерным проявителем кумаринов.
| Метод проявления | Основной аналитический принцип | Типичный результат на хроматограмме | Диагностическая ценность для кумаринов |
|---|---|---|---|
| Реакция азосочетания | Образование окрашенного азосоединения при взаимодействии с диазониевой солью | Жёлтые, оранжевые, розовые или красные пятна | Характерный групповой способ обнаружения кумаринов |
| Ультрафиолетовое облучение | Флуоресценция сопряжённой бензопироновой системы | Голубое, сине-зелёное или зелёное свечение | Удобный предварительный скрининг; усиливается у гидроксилированных кумаринов |
| Раствор хлорида алюминия | Комплексообразование с фенольными гидроксилами и карбонильными группами | Изменение окраски или флуоресценции | Более характерен для флавоноидов; для кумаринов вспомогательный метод |
| Реактив Люголя | Неспецифическое взаимодействие йода с различными органическими соединениями | Коричневые или бурые зоны | Недостаточная специфичность для подтверждения кумаринов |
| Раствор серной кислоты | Кислотно-катализируемые превращения, дегидратация или изменение хромофора | Потемнение, обугливание либо неспецифическое изменение окраски | Может использоваться как общий проявитель, но не является оптимальным критерием |
| Сравнение со стандартом | Совпадение величины Rf и окраски зоны с эталонным веществом | Совпадающее положение и характер пятна | Повышает достоверность идентификации конкретного кумарина |
Результат реакции следует оценивать с учётом условий хроматографии, состава элюента и времени проявления. Для подтверждения идентичности вещества окрашенную зону сопоставляют со стандартным образцом по величине Rf, цвету и флуоресценции в УФ-свете. Наиболее надёжная идентификация достигается сочетанием реакции азосочетания с УФ-детекцией и сравнением со стандартом. Следовательно, положительный ответ основан на характерном образовании окрашенных азопроизводных кумаринов непосредственно в зоне их локализации на хроматограмме.