2) флуориметрией
3) масс-спектрометрией
4) электрофорезом (+)
Электрофорез — метод разделения и анализа веществ, основанный на направленном движении заряженных частиц в электрическом поле. Под действием электростатической силы частицы перемещаются к электроду с противоположным зарядом, а их движение ограничивается сопротивлением среды. Скорость миграции характеризуется электрофоретической подвижностью и зависит от величины заряда, размера и формы частицы, вязкости раствора, pH, ионной силы буфера и напряжённости поля. Различия в подвижности приводят к пространственному разделению компонентов смеси.
В фармацевтическом анализе применяют капиллярный и гель-электрофорез. В капиллярном электрофорезе разделение происходит в тонком капилляре с электролитным буфером, а результат регистрируется в виде электрофореграммы по времени миграции и интенсивности сигнала. Метод используют для определения и идентификации ионов, алкалоидов, аминокислот, пептидов, белков и примесей; особенно важен контроль pH, поскольку он определяет степень ионизации вещества и, следовательно, его электрофоретическую подвижность.
| Метод или вариант | Основной принцип | Определяющий фактор разделения или сигнала | Типичное применение |
|---|---|---|---|
| Капиллярный электрофорез | Миграция ионов в электрическом поле внутри капилляра с электролитным буфером | Электрофоретическая подвижность и электроосмотический поток | Анализ лекарственных веществ, алкалоидов, аминокислот, примесей и продуктов метаболизма |
| Гель-электрофорез | Перемещение заряженных частиц через пористый гель | Сочетание заряда и молекулярного размера; гель оказывает молекулярно-ситовой эффект | Разделение белков, пептидов, нуклеиновых кислот и макромолекулярных компонентов сырья |
| SDS-PAGE | Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия | Преимущественно молекулярная масса, поскольку белки приобретают близкое соотношение заряда и массы | Оценка белкового состава и контроль чистоты биофармацевтических препаратов |
| Изоэлектрофокусирование | Миграция белков в градиенте pH до зоны, где их суммарный заряд становится равным нулю | Изоэлектрическая точка вещества (pI) | Различение белковых изоформ и оценка гетерогенности препаратов |
| ИК-спектроскопия | Поглощение инфракрасного излучения молекулой | Колебательные переходы химических связей и функциональных групп | Идентификация субстанций и установление структуры органических соединений |
| Флуориметрия | Регистрация излучения, испускаемого веществом после возбуждения | Интенсивность и спектр флуоресценции, зависящие от концентрации и строения аналита | Высокочувствительное определение флуоресцирующих веществ или флуоресцентных производных |
| Масс-спектрометрия | Образование и разделение ионов в вакууме | Соотношение массы и заряда (m/z), а также характер фрагментации | Установление молекулярной массы, структуры и примесного состава лекарственных веществ |
Для количественной оценки в электрофорезе используют площадь или высоту пиков, сопоставляя их с калибровочными растворами и внутренним стандартом. Идентификация обычно основана на времени миграции, которое сравнивают с показателями стандартного образца. Надёжность результата повышают стандартизация состава буфера, температуры, напряжения и условий подготовки пробы. Таким образом, ключевым признаком метода является разделение заряженных частиц по их подвижности в электрическом поле.