2) высокоочищенных сахаров
3) высокоочищенных белков (+)
4) высокоочищенных липидов
Вестерн-блот применяют для анализа белковых компонентов иммунобиологических лекарственных препаратов. Сначала белки разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле преимущественно по молекулярной массе, затем переносят на мембрану и выявляют специфическими антителами. Связывание антител с определённым белком позволяет подтвердить его наличие, антигенную идентичность и соответствие ожидаемой молекулярной форме.
Правильным является вариант, связанный с высокоочищенными белками, поскольку именно они служат специфической мишенью иммуноблоттинга. Оценка профиля полос позволяет выявить основной белок, продукты его деградации, модифицированные формы, агрегаты и белковые примеси; наличие одной преобладающей полосы ожидаемой молекулярной массы свидетельствует о соответствии препарата заявленному компоненту и относительной чистоте. Неочищенные белковые смеси могут исследоваться этим методом, но они не являются оптимальной основой для подтверждения подлинности конкретного лекарственного белка.
Сахара и липиды не выявляются в классическом вестерн-блоттинге по такому же принципу: метод основан на электрофоретическом разделении белков и иммунологическом распознавании их эпитопов. Вестерн-блот имеет преимущественно качественное или полуколичественное значение и применяется совместно с масс-спектрометрией, жидкостной хроматографией, капиллярным электрофорезом и методами определения агрегатов.
| Элемент анализа | Принцип | Интерпретируемый результат |
|---|---|---|
| Исследуемый компонент | Высокоочищенный белок с известной антигенной структурой | Возможность специфического подтверждения подлинности лекарственного вещества |
| Электрофоретическое разделение | Разделение денатурированных белков преимущественно по молекулярной массе | Определение положения основной белковой полосы |
| Перенос на мембрану | Иммобилизация белков после электрофореза | Создание доступной для антител матрицы для последующего выявления |
| Первичное антитело | Специфическое связывание с эпитопом целевого белка | Подтверждение иммунологической идентичности компонента |
| Основная полоса | Сопоставление её положения с эталоном или маркером молекулярной массы | Оценка соответствия заявленной молекулярной форме белка |
| Дополнительные полосы | Выявление фрагментов, модифицированных форм или посторонних белков | Признак неоднородности, деградации или снижения чистоты препарата |
| Ограничения метода | Зависимость результата от специфичности антител и сохранности эпитопа | Необходимость подтверждения показателей другими валидированными методами |
Достоверность заключения повышают положительный и отрицательный контроли, стандартный образец и оценка воспроизводимости полос. Отсутствие сигнала не всегда означает отсутствие белка, поскольку эпитоп может быть разрушен денатурацией или закрыт химической модификацией. Поэтому в регистрационном и серийном контроле вестерн-блот рассматривают как часть комплекса методов оценки качества, подлинности и чистоты белкового иммунобиологического препарата.