2) фотометрия
3) поляриметрия
4) рефрактометрия
Флуориметрия основана на регистрации света, испускаемого молекулами анализируемого вещества после предварительного поглощения ими возбуждающего излучения. Поглощение фотона переводит молекулу в возбужденное электронное состояние, а при возвращении к исходному энергетическому уровню часть энергии высвобождается в виде флуоресцентного излучения, обычно имеющего большую длину волны, чем возбуждающий свет. Интенсивность флуоресценции при низких концентрациях прямо связана с содержанием флуоресцирующего соединения, что позволяет использовать метод для его количественного определения.
Флуориметрический анализ отличается высокой чувствительностью и применяется для веществ, обладающих собственной флуоресценцией, а также для соединений, предварительно превращённых в флуоресцентные производные. Интенсивность сигнала зависит от химической структуры вещества, длины волны возбуждения и регистрации, растворителя, pH, температуры и присутствия тушителей флуоресценции. При повышении концентрации возможны отклонения от линейной зависимости вследствие внутреннего фильтра, самотушения и вторичного поглощения излучения.
| Метод | Регистрируемое физическое явление | Основной аналитический сигнал | Типичные объекты или применение |
|---|---|---|---|
| Флуориметрия | Испускание света возбужденными молекулами | Интенсивность флуоресценции | Определение флуоресцирующих лекарственных веществ, витаминов, алкалоидов и флуоресцентных производных |
| Фотометрия | Поглощение веществом электромагнитного излучения | Оптическая плотность или коэффициент пропускания | Количественный анализ окрашенных соединений и продуктов цветных реакций |
| Поляриметрия | Вращение плоскости поляризации света оптически активным веществом | Угол оптического вращения | Идентификация и оценка содержания хиральных соединений, сахаров, эфирных масел |
| Рефрактометрия | Преломление света при переходе между средами | Показатель преломления | Контроль чистоты и концентрации растворов, исследование масел и жидких лекарственных форм |
| Флуориметрический критерий | Наличие эмиссии после возбуждения на заданной длине волны | Спектр и интенсивность испускания | Подтверждение присутствия флуорофора и его количественное определение в низких концентрациях |
Принципиальное отличие флуориметрии состоит в измерении не поглощённого, а испущенного веществом излучения. Благодаря регистрации сигнала под углом к направлению возбуждающего пучка снижается влияние рассеянного света и повышается чувствительность анализа. Для достоверной интерпретации результата необходимо учитывать возможное тушение флуоресценции и матричные эффекты. Таким образом, испускание света возбужденным анализируемым веществом является определяющим признаком флуориметрического метода.