2) серийных разведений
3) титрования
4) вестерн-блот (+)
Вестерн-блот является иммунохимическим методом, позволяющим одновременно оценить молекулярные и антигенные свойства белкового компонента иммунобиологического препарата. Белки предварительно разделяют электрофорезом, обычно в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, затем переносят на мембрану и выявляют специфическими антителами. Появление иммунореактивной полосы в области ожидаемой молекулярной массы подтверждает наличие целевого антигена или белка и тем самым характеризует подлинность препарата. Иммунохимические свойства белка могут использоваться для установления его идентичности, однородности и чистоты.
Чистоту оценивают по профилю обнаруженных полос: дополнительные сигналы могут указывать на агрегаты, фрагменты протеолиза, продукты деградации, молекулярные варианты или примеси, сохраняющие реактивность с используемыми антителами. Метод особенно информативен, когда антитела распознают разные эпитопы целевой молекулы. Вместе с тем абсолютную чистоту биологических препаратов обычно подтверждают комплексом взаимодополняющих методов, поскольку вестерн-блот является преимущественно качественным или полуколичественным исследованием и выявляет только иммунореактивные компоненты.
| Метод | Основной аналитический принцип | Что характеризует | Значение для подлинности и чистоты |
|---|---|---|---|
| Вестерн-блот | Электрофоретическое разделение белков с последующим выявлением специфическими антителами | Антигенную специфичность и молекулярную массу | Подтверждает целевой белок; дополнительные полосы отражают возможные примеси или молекулярные варианты |
| Диффузия в агаре | Образование линии преципитации при встрече антигена и антитела | Наличие антиген-антительного взаимодействия | Может подтвердить антигенную активность, но обладает низкой разрешающей способностью и не разделяет белковые компоненты |
| Серийные разведения | Последовательное уменьшение концентрации исследуемого образца | Титр или предел обнаруживаемой активности | Не устанавливает молекулярную идентичность и не показывает состав примесей |
| Титрование | Количественное взаимодействие определяемого вещества с реагентом известной концентрации | Содержание вещества, активность или нейтрализующую способность | Подходит для количественной оценки, но обычно недостаточно специфично для подтверждения белковой подлинности |
| Электрофорез без иммунодетекции | Разделение компонентов по молекулярной массе или заряду | Гетерогенность и профиль белковых фракций | Оценивает чистоту, но не подтверждает антигенную принадлежность отдельных полос |
| Иммуноферментный анализ | Специфическое связывание антигена с антителом и ферментная регистрация сигнала | Наличие и количество иммунореактивного компонента | Высокоспецифичен, но не предоставляет сведений о молекулярной массе и числе белковых фракций |
Диагностическая ценность вестерн-блота определяется сочетанием двух уровней специфичности: разделением белков по молекулярной массе и последующим распознаванием целевого эпитопа антителом. Совпадение положения основной полосы с референсным образцом служит важным критерием подлинности серии препарата. Изменение интенсивности, смещение полосы или появление дополнительных сигналов может свидетельствовать о деградации, модификации либо неоднородности белка. Для выпуска серии результаты метода сопоставляют со спецификацией и данными других физико-химических, биологических и иммунохимических испытаний.