2) метанол
3) глицерин (+)
4) этанол
В капиллярном изоэлектрическом фокусировании белки перемещаются в электрическом поле по градиенту pH, сформированному амфолитами, до участка, соответствующего их изоэлектрической точке (pI). В этой зоне суммарный электрический заряд белковой молекулы приближается к нулю, электрофоретическая подвижность резко снижается, а электростатическое отталкивание между молекулами становится минимальным. Поэтому растворимость белка уменьшается, молекулы агрегируют и могут осаждаться непосредственно в области собственного значения pI.
Глицерин добавляют для повышения вязкости среды и подавления конвективных потоков и диффузии в капилляре. Благодаря этому стабилизируются градиент pH и сфокусированные белковые зоны, увеличивается время пребывания белка в изоэлектрической области и создаются условия для его концентрирования и осаждения. Таким образом, глицерин не заменяет амфолиты и не формирует pH-градиент, а обеспечивает физическую стабильность процесса, что делает вариант 3 правильным.
Трихлоруксусная кислота, метанол и этанол способны вызывать неспецифическое осаждение или денатурацию белков, но делают это за счёт резкого изменения кислотности, диэлектрической проницаемости и гидратации белковых молекул. Их применение нарушало бы селективность изоэлектрического фокусирования и не позволяло бы связать осаждение с конкретной изоэлектрической точкой.
| Компонент или условие | Основное действие | Значение для капиллярного изоэлектрического фокусирования |
|---|---|---|
| Глицерин | Повышает вязкость раствора, уменьшает конвекцию и диффузионное размывание | Стабилизирует фокусированные зоны и способствует концентрированию белка в области pI |
| Амфолиты | Распределяются в электрическом поле и формируют устойчивый градиент pH | Обеспечивают разделение белков по значениям изоэлектрических точек |
| Изоэлектрическая точка | pH, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен или близок к нулю | Электрофоретическая подвижность минимальна, а растворимость обычно наименьшая |
| Трихлоруксусная кислота | Снижает pH и вызывает денатурацию с неспецифическим осаждением белков | Не подходит для селективного осаждения именно в собственной pI белка |
| Метанол | Изменяет полярность среды, нарушает гидратацию и может денатурировать белки | Вызывает неспецифическое осаждение, не стабилизируя изоэлектрический фокус |
| Этанол | Снижает растворимость белков и изменяет структуру их гидратной оболочки | Может приводить к общему спиртовому осаждению, но не обеспечивает разделение по pI |
Ключевым диагностическим признаком завершения фокусирования является прекращение перемещения белковой зоны и её локализация при определённом значении pH. Осаждение в этой области отражает минимальную растворимость белка, а не действие сильной кислоты или органического растворителя. Поэтому глицерин рассматривается как стабилизирующая добавка, повышающая воспроизводимость и чёткость изоэлектрического фокусирования.