2) BACTEC MGIT 960
3) биологические микрочипы
4) аллель-специфическую ПЦР в режиме реального времени (+)
Аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени обеспечивает минимальное время получения результата, поскольку одновременно выполняет амплификацию целевых участков ДНК и регистрацию флуоресцентного сигнала. Специально подобранные праймеры или зонды различают нормальный и мутантный аллели генов, связанных с устойчивостью Mycobacterium tuberculosis, например мутации в rpoB, katG и промоторной области inhA. Исследование не требует предварительного длительного культивирования возбудителя, поэтому заключение о наличии наиболее распространённых детерминант резистентности может быть получено в течение нескольких часов.
Метод BACTEC MGIT 960 относится к фенотипическому определению чувствительности: устойчивость устанавливают по росту микобактерий в жидкой питательной среде, содержащей противотуберкулёзный препарат. Несмотря на автоматизацию и более высокую скорость по сравнению с посевом на плотные среды, для накопления регистрируемой бактериальной массы требуется несколько суток. ДНК-стриповые технологии и биологические микрочипы также выявляют мутации значительно быстрее культуральных методов, однако обычно включают дополнительные этапы гибридизации, промывки и визуальной либо приборной интерпретации.
Высокая скорость аллель-специфической ПЦР особенно важна при подозрении на лекарственно-устойчивый туберкулёз, поскольку позволяет оперативно скорректировать режим химиотерапии и уменьшить риск назначения заведомо неэффективных препаратов. При этом молекулярный результат характеризует наличие конкретных генетических маркеров резистентности, а не непосредственную способность микобактерий расти при определённой концентрации препарата.
| Метод | Принцип | Ориентировочное время результата | Основные особенности |
|---|---|---|---|
| Аллель-специфическая ПЦР в реальном времени | Амплификация и флуоресцентное выявление заданных мутаций | Несколько часов | Наименьшее время оборота теста; применима непосредственно к клиническому материалу |
| ДНК-стриповая технология | ПЦР с последующей обратной гибридизацией на мембранных полосках | Обычно 1–2 рабочих дня | Одновременное выявление нескольких мутаций, но требуется постамплификационная обработка |
| Биологические микрочипы | Гибридизация амплифицированной ДНК с набором иммобилизованных зондов | От нескольких часов до рабочего дня | Позволяют анализировать широкий набор генетических маркеров; требуют специального оборудования |
| BACTEC MGIT 960 | Регистрация роста микобактерий в жидкой среде с препаратом | Несколько суток после получения культуры | Фенотипическая оценка чувствительности; выявляет устойчивость независимо от конкретной мутации |
| Посев на плотные среды | Сравнение роста на среде с препаратом и без него | Несколько недель | Классический фенотипический подход с наиболее длительным временем ожидания |
| Ограничение молекулярных методов | Определение только включённых в тест мутаций | Не влияет на скорость анализа | Редкие или неизвестные механизмы устойчивости могут не выявляться |
Отрицательный результат аллель-специфической ПЦР не исключает устойчивость, обусловленную редкой мутацией вне исследуемого локуса или иным молекулярным механизмом. При расхождении генотипических данных с клинической картиной или эпидемиологическим анамнезом необходимо фенотипическое тестирование лекарственной чувствительности. Оптимальная лабораторная тактика сочетает быстрый молекулярный скрининг с культуральным исследованием, позволяющим подтвердить жизнеспособность возбудителя и уточнить спектр его чувствительности. Такой подход обеспечивает одновременно раннее начало адекватной терапии и максимальную достоверность окончательного результата.