2) невозможно
3) возможно только при использовании специальных наборов реагентов
4) возможно только при использовании специальных настроек лазеров проточного цитометра
Проточная цитометрия непосредственно определяет иммунофенотип клеток и долю опухолевой популяции среди исследованных клеток, но сама по себе обычно выражает результат в процентах, а не в абсолютных значениях. Если известна концентрация клеток в исходном образце, абсолютное количество опухолевых клеток в единице объёма рассчитывают как произведение общей клеточности на долю опухолевых клеток: Nопух. = Nобщ. × fопух.. При необходимости учитывают разведение материала, жизнеспособность клеток и содержание ядерных клеток.
Таким образом, информация о клеточности образца обеспечивает необходимый знаменатель для пересчёта относительного результата в абсолютный. Например, при концентрации 20 000 ядерных клеток/мкл и опухолевой популяции 10% абсолютное количество опухолевых клеток составляет 2 000/мкл. Альтернативным способом абсолютной стандартизации может быть использование флуоресцентных счётных микросфер, однако наличие специальных наборов реагентов или особых настроек лазеров не является обязательным условием самого расчёта.
Достоверность оценки зависит от правильного выделения опухолевой популяции по совокупности антигенов, качества гейтирования, репрезентативности образца и корректного определения общей клеточной концентрации. Особенно важно отличать абсолютное число клеток от их процентного содержания: высокая доля опухолевых клеток при малой общей клеточности не всегда означает большое абсолютное количество.
| Параметр | Что определяется | Значение для расчёта |
|---|---|---|
| Общая клеточность образца | Количество клеток, обычно ядерных, в единице объёма | Формирует исходный абсолютный знаменатель |
| Опухолевая популяция | Клетки с патологическим иммунофенотипом или специфическим маркером | Определяет долю опухолевых клеток среди проанализированных |
| Относительное содержание | Процент опухолевых клеток в пределах корректно выбранного гейта | Умножается на общую клеточность для получения абсолютного значения |
| Абсолютное содержание | Число опухолевых клеток на микролитр или другой объём | Рассчитывается по формуле: общая клеточность × доля опухолевых клеток |
| Счётные микросферы | Внутренний стандарт с известной концентрацией | Позволяют получить абсолютное число непосредственно в ходе проточной цитометрии |
| Разведение и потери клеток | Изменение концентрации при подготовке и обработке образца | Требуют введения поправочного коэффициента, иначе абсолютный результат будет искажён |
| Жизнеспособность клеток | Доля жизнеспособных и погибших клеток | Определяет, относится ли расчёт к общему числу клеток или к жизнеспособной популяции |
Абсолютная оценка опухолевой клеточной массы особенно полезна при мониторинге минимальной остаточной болезни и сравнении образцов в динамике. Для сопоставимости результатов необходимо использовать одинаковые критерии гейтирования и единицы измерения. При недостаточной клеточности, выраженной гемодилюции или нерепрезентативном материале расчёт может быть недостоверным. Поэтому абсолютное число следует интерпретировать вместе с морфологией, клиническими данными и другими лабораторными методами.