2) демеколцина
3) цитохалазина B (+)
4) митомицина С
Цитохалазин B применяют для блокирования цитокинеза — разделения цитоплазмы после завершения кариокинеза. Препарат нарушает полимеризацию актина и формирование сократительного кольца, поэтому дочерние ядра образуются, но клетка не разделяется на две дочерние клетки. В результате после одного митотического цикла формируются стабильные двухъядерные лимфоциты, удобные для последующего FISH-исследования.
В культуре лимфоцитов периферической крови сначала индуцируют пролиферацию, обычно фитогемагглютинином, а затем добавляют цитохалазин B в период, когда ожидается завершение первого клеточного деления. FISH с использованием центромерных, локус-специфичных или хромосомных зондов позволяет оценивать распределение определённых последовательностей ДНК, а также выявлять анеуплоидию, нерасхождение хромосом и другие геномные нарушения в двухъядерных клетках. Такой подход также используется в цитокинез-блокированном микроядерном тесте.
Колхицин и демеколцин действуют преимущественно на микротрубочки веретена деления и вызывают остановку клеток в метафазе, поэтому предназначены главным образом для получения метафазных пластинок при цитогенетическом анализе. Митомицин C повреждает ДНК, образуя межцепочечные сшивки и индуцируя хромосомные аберрации, но не обеспечивает селективной блокады цитокинеза. Следовательно, именно цитохалазин B создаёт необходимый фенотип двухъядерной клетки при сохранённом ядерном делении.
| Воздействие или критерий | Основная мишень | Результат в клеточном цикле | Значение для цитогенетического исследования |
|---|---|---|---|
| Цитохалазин B | Актиновый цитоскелет, сократительное кольцо | Кариокинез сохраняется, цитокинез блокируется; формируется двухъядерная клетка | Основной реагент для цитокинез-блокированного FISH- и микроядерного анализа |
| Колхицин | Микротрубочки веретена деления | Нарушение формирования веретена и остановка в метафазе | Получение метафазных пластинок и анализ кариотипа, а не селективная блокада цитокинеза |
| Демеколцин | Микротрубочки, тубулин | Митотическая остановка, преимущественно на стадии метафазы | Альтернатива колхицину в метафазном анализе; двухъядерные клетки целенаправленно не формирует |
| Митомицин C | ДНК; образование межцепочечных сшивок | Репликационный стресс, повреждение ДНК, хромосомные аберрации | Используется для оценки генотоксичности и репарации, но не для блокады цитокинеза |
| Двухъядерный лимфоцит | Результат одного завершённого ядерного деления без разделения цитоплазмы | Два дочерних ядра находятся в одной клетке | Удобная единица учёта при анализе микроядер, анеуплоидии и распределения FISH-сигналов |
| FISH-зонд | Комплементарная последовательность ДНК определённого локуса или хромосомы | Флуоресцентная гибридизация с визуализацией специфических сигналов | Позволяет выявлять количественные и структурные нарушения конкретных хромосомных мишеней |
Ключевой диагностический признак действия цитохалазина B — появление жизнеспособных двухъядерных клеток при отсутствии подавления ядерного деления. Блокада на уровне цитокинеза позволяет сравнивать клетки, прошедшие одинаковое число делений, и повышает стандартизированность подсчёта генетических нарушений. Интерпретация результатов FISH должна учитывать тип использованных зондов, число проанализированных клеток и критерии оценки ядерных и внеядерных сигналов. Поэтому в данной методике цитохалазин B является специфическим средством создания двухъядерной клеточной модели.