2) флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с субтеломерными ДНК-зондами (+)
3) флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с центромеро-специфичными ДНК-зондами
4) мультицветной флуоресцентной in situ гибридизацией (mFISH)
Для выявления терминальной делеции применяют FISH с субтеломерными ДНК-зондами. Такие зонды комплементарны участкам, расположенным непосредственно перед теломерой — концевым повторяющимся последовательностям хромосомы. При утрате терминального фрагмента соответствующий флуоресцентный сигнал отсутствует на одной из гомологичных хромосом, тогда как контрольные сигналы на сохранённом участке или центромере позволяют подтвердить, что результат связан именно с делецией, а не с техническим дефектом гибридизации.
Метод особенно важен для обнаружения небольших или субмикроскопических терминальных делеций, которые могут быть неразличимы при стандартном цитогенетическом исследовании. Такие перестройки способны лежать в основе задержки психомоторного развития, интеллектуальной недостаточности, врождённых пороков и характерного дисморфического фенотипа. Цельнохромосомные зонды преимущественно выявляют крупные перестройки и происхождение хромосомного материала, центромерные зонды — число центромер и анеуплоидии, а mFISH предназначена главным образом для анализа сложных обменных перестроек между хромосомами, но не является оптимальным методом поиска малых концевых потерь.
| Метод или тип зонда | Основная диагностическая задача | Возможность выявления терминальной делеции | Типичный результат |
|---|---|---|---|
| Субтеломерные ДНК-зонды | Исследование дистальных участков конкретных хромосом | Высокая; метод выбора для адресного поиска концевой потери | Отсутствие сигнала на одном гомологе при сохранении контрольного сигнала |
| Цельнохромосомные ДНК-зонды | Идентификация крупных хромосомных сегментов и материала при перестройках | Ограниченная при малом размере делеции | Окрашивание всей хромосомы или крупного её фрагмента |
| Центромеро-специфичные зонды | Определение числа хромосом или центромерных областей | Не выявляют удаление дистального участка, если центромера сохранена | Число центромерных сигналов соответствует числу исследуемых хромосом |
| mFISH | Одновременная дифференциация всех хромосом при сложных перестройках | Недостаточная чувствительность к небольшим терминальным потерям | Каждая хромосома имеет специфический цветовой профиль |
| Стандартное кариотипирование | Оценка крупных структурных и числовых аномалий | Выявляет только достаточно крупные терминальные делеции | Видимое укорочение длинного плеча или короткого плеча хромосомы |
| Микроматричный анализ (array-CGH/SNP-array) | Геномный поиск копийных потерь и приобретений | Высокая, включая субмикроскопические делеции; не всегда определяет сбалансированные перестройки | Изменение дозы ДНК в терминальном участке хромосомы |
Интерпретация FISH должна учитывать наличие внутреннего контрольного сигнала и сопоставление с нормальным гомологом. При обнаружении терминальной делеции целесообразно уточнить её размер и генный состав методом хромосомного микроматричного анализа или секвенирования. Для оценки происхождения перестройки и риска её повторения проводят исследование кариотипа родителей, поскольку причиной может быть наследуемая сбалансированная транслокация. Клиническая значимость результата определяется сочетанием цитогенетических данных с фенотипом пациента и генетическим консультированием.