2) полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени
3) секвенирование по Сэнгеру
4) массовое параллельное секвенирование
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) относится к молекулярно-цитогенетическим методам, поскольку сочетает молекулярную специфичность ДНК-зондов с цитогенетической оценкой их расположения непосредственно в клетке или на хромосомах. Флуоресцентно меченый зонд комплементарно связывается с определённой последовательностью ДНК; сигнал регистрируют в интерфазных ядрах или на препарате метафазных хромосом. Число, локализация и характер сигналов позволяют выявлять анеуплоидии, микроделеции и микродупликации, амплификацию генов, а также транслокации и другие структурные перестройки.
Метод применяют для быстрой целевой диагностики, например при подозрении на трисомии 13, 18 и 21, микроделеционный синдром 22q11.2 или транслокацию с образованием гена BCR::ABL1. FISH может выполняться без получения метафазных клеток, что особенно важно при исследовании не делящихся клеток и при необходимости быстрого результата. Ограничением является таргетный характер исследования: обнаруживаются только те хромосомные участки, для которых заранее выбраны соответствующие зонды.
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, секвенирование по Сэнгеру и массовое параллельное секвенирование относятся преимущественно к молекулярно-генетическим методам. Они анализируют амплифицированные или секвенированные фрагменты нуклеотидной последовательности, но не определяют их расположение на хромосоме в клеточном ядре. Эти подходы особенно эффективны для выявления точечных вариантов и небольших инделов, тогда как FISH непосредственно демонстрирует цитогенетический паттерн распределения конкретной последовательности.
| Метод | Основной объект анализа | Тип выявляемых изменений | Цитогенетическая особенность | Типичный результат |
|---|---|---|---|---|
| FISH | Определённый локус, центромерный или теломерный участок | Анеуплоидии, микроделеции, микродупликации, транслокации, амплификация | Визуализация флуоресцентных сигналов в ядре или на хромосоме | Число и расположение сигналов, наличие слияния или расщепления сигналов |
| ПЦР в режиме реального времени | Амплифицируемый участок ДНК | Известные точечные варианты, небольшие инделы, количественная оценка отдельных мишеней | Не показывает положение последовательности на хромосоме | Кривая амплификации, пороговый цикл, относительное или абсолютное количество ДНК |
| Секвенирование по Сэнгеру | Ограниченный фрагмент гена | Точечные замены и небольшие инделы | Локус анализируется на уровне нуклеотидной последовательности | Хроматограмма с последовательностью исследуемого фрагмента |
| Массовое параллельное секвенирование | Панель генов, экзом или геном | Широкий спектр однонуклеотидных вариантов, инделов; частично CNV и структурные варианты | Высокая геномная производительность без прямой визуализации хромосом | Набор вариантов с указанием координат, глубины покрытия и аллельной доли |
| Кариотипирование | Все метафазные хромосомы | Числовые аномалии и крупные структурные перестройки | Морфологическая оценка полного хромосомного набора | Кариограмма с описанием числа и структуры хромосом |
| Хромосомный микроматричный анализ | Тысячи участков генома | Субмикроскопические делеции и дупликации, изменения числа копий | Молекулярно-цитогенетический скрининг почти всего генома, но без надёжного выявления сбалансированных перестроек | Профиль вариаций числа копий и участков потери гетерозиготности |
Выбор FISH обоснован необходимостью подтвердить конкретную хромосомную аномалию с сохранением информации о её клеточной локализации. Интерпретация результата должна учитывать контрольные сигналы, качество гибридизации и возможность мозаицизма. При неизвестной причине задержки развития или множественных врождённых пороков более широкую диагностическую стратегию часто начинают с хромосомного микроматричного анализа или секвенирования. Отрицательный результат FISH исключает только те изменения, для поиска которых были использованы выбранные зонды.