2) количественной ПЦР
3) ник-трансляции (+)
4) капельной цифровой ПЦР
Ник-трансляция является классическим способом введения флуоресцентной метки в ДНК-зонды для FISH. На первом этапе ДНК-зонд обрабатывают ДНКазой I, которая формирует одноцепочечные разрывы — ники . Затем ДНК-полимераза I, обладая 5′→3′-экзонуклеазной и полимеразной активностью, удаляет нуклеотиды перед разрывом и достраивает цепь, включая в нее меченые флуоресцентными красителями дНТФ.
В результате формируется фрагмент ДНК с равномерно распределенными флуорофорами, способный специфически гибридизоваться с комплементарной последовательностью в нативной или фиксированной клетке. После отмывки несвязавшегося материала участки связывания зонда визуализируют методом флуоресцентной микроскопии. Метка может быть прямой, например флуоресцеиновой или родаминовой, либо косвенной — через биотин или дигоксигенин с последующей детекцией флуоресцентно меченым связывающим белком.
| Метод или подход | Основной принцип | Роль в FISH |
|---|---|---|
| Ник-трансляция | Ферментативная замена фрагментов ДНК с включением меченых дНТФ | Стандартное получение флуоресцентно меченых ДНК-зондов |
| Обратная ПЦР | Амплификация неизвестных фланкирующих последовательностей после циркуляризации ДНК | Изучение структуры локуса, а не рутинное нанесение метки на зонд |
| Количественная ПЦР | Регистрация накопления ампликона в реальном времени по флуоресцентному сигналу | Определение количества нуклеиновой кислоты; не является базовым методом маркировки FISH-зонда |
| Капельная цифровая ПЦР | Разделение образца на множество микрореакций и абсолютный подсчет положительных капель | Высокочувствительная количественная диагностика, но не стандартная технология подготовки FISH-зондов |
| Прямая флуоресцентная метка | Флуорофор непосредственно включен в состав зонда | Позволяет сразу визуализировать гибридизационный сигнал |
| Непрямая метка | Зонд содержит гаптен, который выявляют флуоресцентно меченым лигандом или антителом | Может усиливать сигнал, но требует дополнительной стадии детекции |
Выбор ник-трансляции обусловлен тем, что метод обеспечивает контролируемое включение флуоресцентных нуклеотидов без необходимости амплификации целевого фрагмента. Размер получаемых фрагментов обычно оптимизируют для эффективного проникновения и гибридизации в клеточном материале. Специфичность FISH определяется комплементарностью зонда исследуемой последовательности, а интенсивность сигнала — качеством мечения, доступностью мишени и условиями гибридизации.