2) анеуплоидию в сперматозоидах
3) точковые мутации ДНК
4) нарушение конденсации хроматина
Метод TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) выявляет фрагментацию ДНК по наличию свободных 3’-гидроксильных концов, образующихся при разрывах фосфодиэфирного остова. Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза присоединяет к этим концам меченые нуклеотиды, после чего сигнал регистрируют иммуногистохимически, флуоресцентной микроскопией или проточной цитометрией. Поэтому метод позволяет обнаруживать как однонитевые, так и двунитевые разрывы ДНК.
Наиболее часто TUNEL применяют для оценки апоптотической гибели клеток, поскольку при апоптозе активируются эндонуклеазы и возникает выраженная фрагментация геномной ДНК. Однако реакция не является абсолютно специфичной для апоптоза: положительный сигнал возможен также при некрозе, ишемическом повреждении, воздействии генотоксических факторов и выраженном окислительном стрессе. Интенсивность или доля TUNEL-положительных клеток характеризует степень повреждения ДНК, но должна интерпретироваться вместе с морфологическими и молекулярными признаками клеточной гибели.
| Метод | Основная мишень | Принцип и диагностическое значение |
|---|---|---|
| TUNEL | Свободные 3’-OH-концы ДНК | Меченые нуклеотиды присоединяются TdT к участкам одно- и двунитевых разрывов; применяется для оценки фрагментации ДНК и апоптоза. |
| Кометный электрофорез | Повреждения и разрывы ДНК в отдельных клетках | При электрофорезе фрагменты формируют хвост кометы ; длина и интенсивность хвоста отражают степень генотоксического повреждения. |
| FISH с центромерными или локус-специфическими зондами | Число и расположение хромосомных сигналов | Используется для выявления анеуплоидии, микроделеций и отдельных структурных перестроек, в том числе в сперматозоидах. |
| Кариотипирование и ДНК-цитометрия | Набор хромосом или содержание ДНК | Позволяют оценивать численные и крупные структурные хромосомные аномалии, но не предназначены для обнаружения единичных разрывов ДНК. |
| ПЦР, Sanger-секвенирование, NGS | Нуклеотидная последовательность ДНК | Выявляют точковые варианты, небольшие инсерции и делеции; не определяют общий уровень фрагментации генома методом маркировки 3’-OH-концов. |
| Морфологическая оценка хроматина | Степень конденсации и архитектура ядра | Проводится с помощью микроскопии и специальных окрашиваний; позволяет оценить конденсацию хроматина, но не дает прямого молекулярного подтверждения разрывов ДНК. |
В репродуктивной генетике TUNEL может использоваться для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов и анализа влияния окислительного стресса, воспаления или токсических факторов на их геном. Анеуплоидия требует методов, определяющих число хромосом, прежде всего FISH или цитогенетического анализа. Точковые мутации устанавливают посредством секвенирования или аллель-специфической ПЦР, а нарушение конденсации хроматина оценивают морфологически либо с использованием специальных биохимических тестов.