2) хромосомного микроматричного анализа
3) флуоресцентной гибридизации in situ
4) секвенирования ДНК (+)
Патогенный вариант CFTR p.Phe508del (часто обозначается как p.F508del) представляет собой делецию трех нуклеотидов c.1521_1523delCTT, приводящую к выпадению фенилаланина в позиции 508 белка CFTR. Это небольшая внутрирамочная делеция, не изменяющая рамку считывания, но нарушающая фолдинг и транспорт хлоридного канала к апикальной мембране эпителиальных клеток; вариант относится преимущественно к классу II дефектов CFTR и является наиболее частой причиной муковисцидоза.
Выявление такого варианта требует анализа последовательности нуклеотидов, поэтому правильным методом является секвенирование ДНК — методом Сэнгера или в составе NGS-панели. При секвенировании определяется отсутствие трех нуклеотидов в соответствующем участке гена, что позволяет подтвердить генотип и установить зиготность варианта. Метил-чувствительная ПЦР исследует преимущественно состояние метилирования, хромосомный микроматричный анализ предназначен главным образом для выявления крупных делеций и дупликаций, а FISH — для обнаружения крупных хромосомных перестроек; трехнуклеотидная делеция обычно находится ниже их разрешающей способности.
| Метод | Основная диагностическая мишень | Возможность выявления p.Phe508del | Практическое значение |
|---|---|---|---|
| Секвенирование ДНК | Замены нуклеотидов, небольшие делеции и инсерции | Да | Основной способ обнаружения трехнуклеотидной делеции в CFTR |
| Секвенирование по Сэнгеру | Анализ конкретного экзона или участка гена | Да | Подтверждение ранее выявленного варианта или исследование целевого фрагмента |
| Массивное параллельное секвенирование (NGS) | Одновременное исследование множества генов или полного CFTR | Да | Поиск частых и редких патогенных вариантов в составе генетической панели |
| Хромосомный микроматричный анализ | Копийные изменения значительного размера, микроделеции и микродупликации | Как правило, нет | Не предназначен для обнаружения малых внутригенных делеций размером в несколько пар оснований |
| FISH | Крупные хромосомные перестройки и локус-специфические делеции | Нет | Разрешающая способность недостаточна для стандартной диагностики p.Phe508del |
| Метил-чувствительная ПЦР | Метилирование ДНК в участках, чувствительных к рестрикции | Нет как стандартный метод | Применяется для эпигенетических исследований, а не для поиска данной последовательностной мутации |
При диагностике муковисцидоза молекулярный результат оценивают вместе с клиническими признаками, результатом потовой пробы и, при необходимости, функциональными тестами CFTR. Для подтверждения заболевания обычно требуется выявление патогенных вариантов в обеих аллелях гена либо сочетание генетических и функциональных критериев. Если стандартное секвенирование не выявляет второй вариант у пациента с убедительной клинической картиной, дополнительно исследуют крупные делеции и дупликации методом анализа числа копий.