2) флуоресцентной гибридизации in situ
3) метилчувствительной ПЦР
4) хромосомного микроматричного анализ
Вариант 1 является правильным: мультиплексная лигазо-зависимая амплификация зондов (MLPA) позволяет выявлять делецию CFTR c.1521_1523delCTT, соответствующую варианту p.Phe508del (p.F508del). Это трехнуклеотидная делеция без сдвига рамки считывания, приводящая к утрате фенилаланина в положении 508 белка CFTR. Для обнаружения данной мутации используется специфический зонд: при отсутствии соответствующей последовательности его гибридизация и последующее лигирование нарушаются, что приводит к снижению или отсутствию сигнала при капиллярном электрофоретическом анализе.
MLPA основана на одновременной гибридизации и лигировании множества пар зондов с участками гена, поэтому первоначально метод предназначен для выявления делеций и дупликаций экзонов. Однако специальные наборы содержат мутационно-специфичные зонды и позволяют обнаруживать отдельные распространенные небольшие инделы, включая p.Phe508del. При интерпретации результата важно учитывать, что выявление одной копии варианта не подтверждает заболевание само по себе: муковисцидоз наследуется аутосомно-рецессивно, поэтому требуется поиск патогенного варианта во второй аллели и сопоставление с клиническими и функциональными данными.
Флуоресцентная гибридизация in situ применяется преимущественно для обнаружения крупных хромосомных перестроек и обычно не разрешает трехпарную делецию в гене. Метилчувствительная ПЦР исследует состояние метилирования ДНК, а не структуру кодирующей последовательности CFTR. Хромосомный микроматричный анализ выявляет изменения числа копий генетического материала, но не предназначен для диагностики малых внутригенных вариантов размером в несколько нуклеотидов.
| Метод или признак | Основной принцип | Возможность выявления p.Phe508del | Типичные диагностические задачи |
|---|---|---|---|
| MLPA со специфическим зондом | Гибридизация, лигирование и количественная амплификация зондов; отсутствие сигнала указывает на нарушение участка связывания | Да, при наличии в наборе зонда к c.1521_1523delCTT | Распространенные инделы, делеции и дупликации экзонов CFTR |
| Секвенирование гена CFTR | Определение нуклеотидной последовательности экзонов и прилегающих участков | Да, непосредственно выявляет трехнуклеотидную делецию | Поиск точечных вариантов и малых инделов; уточнение второго патогенного аллеля |
| FISH | Гибридизация флуоресцентно меченого зонда с хромосомным участком in situ | Обычно нет: разрешение недостаточно для трехнуклеотидной делеции | Крупные делеции, транслокации, анеуплоидии и другие цитогенетические перестройки |
| Метилчувствительная ПЦР | Амплификация участков после обработки рестриктазой, чувствительной к метилированию | Нет: оценивает эпигенетическое состояние, а не кодирующую мутацию | Исследование метилирования и нарушений импринтинга |
| Хромосомный микроматричный анализ | Сравнительная оценка числа копий участков генома по интенсивности гибридизации | Нет: трехпарная делеция обычно меньше разрешающей способности метода | Субмикроскопические CNV, микроделеции и микродупликации |
| Клиническое подтверждение муковисцидоза | Сочетание патогенных вариантов в двух аллелях с признаками дисфункции CFTR | Сам по себе один вариант p.Phe508del диагноз не устанавливает | Потовая проба с определением хлоридов, функциональные тесты CFTR и оценка фенотипа |
При отрицательном результате таргетного исследования p.Phe508del муковисцидоз не исключается, поскольку заболевание вызывают многочисленные другие варианты гена CFTR. Для комплексной диагностики применяют панель частых мутаций или полное секвенирование с последующим MLPA при подозрении на крупные делеции и дупликации. Результаты молекулярного анализа интерпретируют с учетом классификации вариантов по клинической значимости и данных о функции CFTR.