2) CISS с хромосомо-специфичными ДНК-библиотеками
3) сравнительная геномная гибридизация
4) хромосомная микродиссекция с обратным окрашиванием (+)
Хромосомная микродиссекция с обратным окрашиванием позволяет непосредственно установить происхождение малой сверхчисленной маркерной хромосомы (sSMC), когда её морфология не даёт возможности определить исходную хромосому. Маркер выделяют из метафазной пластинки, амплифицируют полученную ДНК, например методом DOP-PCR, флуоресцентно метят и используют как зонд для гибридизации с нормальными метафазными хромосомами. Локализация сигнала показывает, из какой хромосомы или её участка сформирован маркер, а характер покрытия позволяет судить о наличии эухроматиновых последовательностей.
Метод особенно ценен при кольцевых, инвертированных, изодицентрических и сложных маркерных хромосомах, а также при мозаицизме. В отличие от центромер-специфичной FISH, которая подтверждает наличие центромеры и иногда позволяет определить её тип, микродиссекция с обратным окрашиванием идентифицирует именно хромосомное происхождение маркера и его геномный состав. Полученные данные могут быть дополнены таргетной FISH или хромосомным микроматричным анализом для оценки дозы генетического материала и уточнения клинически значимых дупликаций.
| Метод | Основная диагностическая информация | Ограничения при sSMC |
|---|---|---|
| Хромосомная микродиссекция с обратным окрашиванием | Определяет происхождение маркера, соответствующую хромосому и наличие эухроматиновых участков | Требует качественных метафаз и последующей амплификации материала; технически трудоёмок |
| FISH с центромеро-специфичными зондами | Выявляет центромерные альфа-сателлитные последовательности и может указать на принадлежность центромеры | Не характеризует большинство эухроматиновых участков и не всегда определяет структуру маркера |
| CISS с хромосомо-специфичными ДНК-библиотеками | Окрашивает целую хромосому и помогает выявлять крупные обмены или значительные производные хромосомы | Для очень малых или сложных маркеров сигнал может быть недостаточным; повторяющиеся последовательности ограничивают разрешение |
| Сравнительная геномная гибридизация | Определяет относительные потери и приобретения генетического материала во всём геноме | Не показывает цитогенетическую локализацию маркера; малые, мозаичные или преимущественно гетерохроматиновые sSMC могут не выявляться |
| Микроматричный анализ | Уточняет размер дупликации и перечень затронутых генов с высоким разрешением | Не заменяет структурную идентификацию маркерной хромосомы и может не обнаружить балансные перестройки |
| Комбинированное цитогенетическое исследование | Сочетает микродисsection, FISH и анализ числа копий для полной характеристики sSMC | Выбор дополнительных методов зависит от размера маркера, уровня мозаицизма и предполагаемого происхождения |
Идентификация sSMC имеет клиническое значение, поскольку фенотип определяется не только наличием дополнительной хромосомы, но и объёмом содержащегося в ней эухроматина. Наиболее неблагоприятны маркеры, включающие функционально активные гены или их регуляторные области. После установления происхождения маркера необходимо оценить мозаицизм, содержание генов и соответствие выявленной перестройки клиническим проявлениям пациента.