2) секвенирование гена РАН
3) NGS-секвенирование экзома
4) микроматричный анализ хромосом
Фенилкетонурия обусловлена патогенными вариантами в гене PAH, кодирующем фенилаланингидроксилазу. Дефицит этого фермента нарушает превращение фенилаланина в тирозин, что приводит к накоплению фенилаланина и его токсичных метаболитов; без своевременного лечения это может вызвать выраженное поражение центральной нервной системы и интеллектуальную недостаточность. Молекулярное исследование обычно выполняют после выявления гиперфенилаланинемии при неонатальном скрининге и подтверждения биохимического нарушения.
Первым этапом генетического поиска являются анализ наиболее частых для данной популяции мутаций в PAH. Такой таргетный тест быстрее и экономичнее полного секвенирования, а обнаружение двух патогенных вариантов в транс-положении подтверждает аутосомно-рецессивную природу заболевания. Если частые варианты не выявлены либо обнаружен только один вариант, переходят к секвенированию всех кодирующих экзонов и прилежащих участков сплайсинга гена PAH, при необходимости дополняя исследование анализом крупных делеций и дупликаций.
Экзомное NGS-исследование не является оптимальным стартовым методом при типичной фенилкетонурии, поскольку оно шире, дороже и может выявлять случайные находки, не относящиеся к причине гиперфенилаланинемии. Микроматричный анализ хромосом предназначен главным образом для обнаружения вариаций числа копий и хромосомных перестроек, тогда как большинство патогенных вариантов в PAH представляют собой точечные замены или небольшие инделы, которые этим методом обычно не выявляются.
| Метод | Основная диагностическая задача | Место в алгоритме |
|---|---|---|
| Анализ частых вариантов в PAH | Выявление распространённых патогенных аллелей с помощью таргетных ПЦР-тестов или иных специфичных методов | Первый этап молекулярно-генетического исследования при типичной фенилкетонурии |
| Секвенирование всего гена PAH | Поиск редких вариантов в экзонах, сайтах сплайсинга и прилежащих областях | Следующий этап при отрицательном результате таргетного анализа или выявлении только одного варианта |
| Анализ делеций и дупликаций, например MLPA | Выявление крупных изменений числа копий экзонов или всего гена | Дополнение секвенирования при отсутствии полного молекулярного объяснения фенотипа |
| NGS-панель генов гиперфенилаланинемии | Одновременное исследование PAH и генов обмена тетрагидробиоптерина, включая PTS и QDPR | Целесообразна при атипичном течении или подозрении на дифференциальный диагноз |
| Экзомное секвенирование | Широкий поиск вариантов во множестве генов при неясном или синдромальном фенотипе | Резервный или расширенный метод после отрицательных целевых исследований |
| Микроматричный анализ хромосом | Обнаружение крупных делеций, дупликаций и дисбалансов хромосомного материала | Не является стандартным первым тестом при изолированной фенилкетонурии |
| Определение фенилаланина и тирозина | Подтверждение гиперфенилаланинемии и оценка соотношения аминокислот | Биохимическая основа диагностики и интерпретации генетического результата |
При интерпретации результата учитывают уровень фенилаланина, остаточную активность фермента и соответствие выявленных вариантов клиническому фенотипу. При выраженной гиперфенилаланинемии и отсутствии двух вариантов в PAH необходимо исключать дефекты обмена тетрагидробиоптерина с помощью определения птеринов и активности дигидроптеридинредуктазы. Раннее подтверждение диагноза позволяет своевременно назначить диету с ограничением фенилаланина и определить возможность терапии сапроптерином у чувствительных пациентов.