2) большая разрешающая возможность
3) возможность использования меньшего набора флуорохромов для создания ДНК-зондов
4) стоимость оборудования
Спектральное кариотипирование (SKY) основано на регистрации полного спектра флуоресцентного излучения в каждой точке изображения. Наборы хромосомоспецифичных зондов получают уникальные комбинации флуорохромов, после чего программный алгоритм сопоставляет спектральную сигнатуру каждого участка с эталонным классом и присваивает всем 24 типам человеческих хромосом условные цвета. Такой принцип позволяет распознавать хромосомный материал не только по форме и положению хромосомы, но и по его спектральным характеристикам.
При частичном наложении хромосом на метафазной пластинке SKY сохраняет возможность определить их принадлежность по спектрам участков, свободных от перекрытия, и проследить соответствующие спектральные профили в зоне контакта. В mFISH изображение формируется последовательной регистрацией сигналов через отдельные фильтры для каждого флуорохрома; сумма интенсивностей в области наложения может образовывать неоднозначную комбинацию каналов и затруднять классификацию. Преимущество SKY особенно значимо при исследовании сложных опухолевых кариотипов, содержащих многочисленные транслокации и маркерные хромосомы, хотя полное наложение или неудовлетворительное качество метафазы по-прежнему могут ограничивать интерпретацию.
| Критерий сравнения | SKY | mFISH |
|---|---|---|
| Принцип регистрации | Определение полного спектра излучения каждого пикселя методом спектральной визуализации | Последовательная регистрация интенсивности флуоресценции в нескольких дискретных каналах |
| Идентификация хромосом | Классификация по уникальной спектральной сигнатуре | Классификация по комбинации наличия и интенсивности сигналов отдельных флуорохромов |
| Частично наложенные хромосомы | Могут включаться в анализ при наличии участков, позволяющих установить спектральную принадлежность | Смешение сигналов в отдельных каналах чаще затрудняет однозначное разделение объектов |
| Диагностическое применение | Выявление межхромосомных перестроек, сложных транслокаций и происхождения маркерных хромосом | Решение сходных задач многоцветного кариотипирования |
| Разрешающая способность | Определяется преимущественно размером и составом хромосомоспецифичных painting-зондов | Сопоставима с SKY при использовании аналогичных зондов; самостоятельного преимущества по разрешению обычно нет |
| Число флуорохромов | Несколько красителей используются в различных комбинациях для кодирования всех хромосом | Также применяется комбинаторное мечение; обязательного преимущества по числу красителей нет |
| Оборудование | Требует спектрального микроскопа, интерферометрической системы и специализированного программного обеспечения | Использует набор флуоресцентных фильтров и систему многоканальной регистрации |
SKY и mFISH относятся к методам многоцветной FISH и имеют близкую диагностическую направленность, поэтому различия между ними обусловлены главным образом способом получения и обработки изображения. Оба подхода эффективно выявляют крупные межхромосомные перестройки, но не заменяют высокоразрешающие методы при поиске небольших внутрихромосомных делеций, дупликаций или точных точек разрыва. Результаты спектрального кариотипирования следует сопоставлять с обычным дифференциальным окрашиванием, локус-специфической FISH либо хромосомным микроматричным анализом. Комплексное использование методов позволяет точнее охарактеризовать структурную перестройку и оценить её клиническое значение.