2) цифры на измерительной шкале
3) пики одного цвета
4) пики разных цветов (+)
При автоматическом секвенировании ДНК, прежде всего методом Сэнгера с капиллярным электрофорезом, результат регистрируется в виде электрофореграммы, или хроматограммы. Каждый из четырех типов нуклеотидов распознается по флуоресцентной метке, связанной с соответствующим дидезоксинуклеотидом-терминатором. Поэтому последовательность отображается как серия пиков разных цветов: цвет кодирует конкретное основание, а положение пика по оси времени или миграции соответствует его месту в анализируемой последовательности.
Механизм основан на прекращении синтеза цепи ДНК после включения флуоресцентно меченного дидезоксинуклеотида (ddNTP), лишенного 3′-OH-группы. Полученные фрагменты различной длины разделяются методом капиллярного электрофореза, после чего лазер возбуждает флуорофоры, а детектор регистрирует спектр излучения. Программное обеспечение преобразует последовательность флуоресцентных сигналов в пики, причем каждому основанию — A, T, G или C — соответствует свой спектральный канал и, следовательно, свой цвет.
Диагностически важны не только цвета пиков, но и их форма, высота и степень разделения. Четкие одиночные пики обычно свидетельствуют о надежном определении нуклеотида, тогда как перекрывающиеся или двойные пики могут указывать на гетерозиготный вариант, низкое качество секвенирования либо смесь ДНК-матриц. Именно поэтому электрофореграмма используется для визуальной верификации автоматически определенной последовательности и подтверждения выявленных генетических вариантов.
| Признак электрофореграммы | Интерпретация |
|---|---|
| Пики разных цветов | Каждый цвет соответствует одному из четырех азотистых оснований A, T, G или C |
| Последовательность одиночных четких пиков | Высокое качество считывания нуклеотидной последовательности |
| Положение пика по горизонтальной оси | Отражает порядок миграции фрагментов и положение нуклеотида в последовательности |
| Двойные пики сопоставимой интенсивности в одной позиции | В диплоидном геноме могут соответствовать гетерозиготной однонуклеотидной замене |
| Широкие или перекрывающиеся пики | Могут быть следствием недостаточного разрешения, низкого качества образца или технических помех |
| Снижение интенсивности сигналов к концу чтения | Характерно для ухудшения качества секвенирования на удаленных участках фрагмента |
| Множественные наложенные сигналы после определенной позиции | Возможны при гетерозиготной вставке или делеции, вызывающей сдвиг последующего чтения |
Таким образом, разные цвета пиков являются способом спектрального кодирования четырех нуклеотидов при автоматическом секвенировании. Само разделение фрагментов обеспечивается электрофорезом, а их идентификация — регистрацией флуоресценции специфических меток. Оценка электрофореграммы позволяет одновременно установить последовательность ДНК и проконтролировать достоверность отдельных нуклеотидных позиций. При клинической интерпретации генетического варианта качество и характер пиков обязательно учитываются наряду с данными автоматического base calling.