2) гибридизации хромосом-специфичных ДНК-библиотек гиббона на метафазных хромосомах человека (+)
3) сравнительной геномной гибридизации двух геномных ДНК-библиотек, полученных от пациента и гиббона, на метафазных хромосомах гиббона
4) сравнительной геномной гибридизации двух геномных ДНК-библиотек, полученных от пациента и гиббона, на метафазных хромосомах человека
RX-FISH (межвидовая многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ, или cross-species color banding) основана на нанесении хромосом-специфичных ДНК-библиотек гиббона на метафазные хромосомы человека. Благодаря эволюционно сохранённой гомологии последовательностей зонды связываются с соответствующими участками человеческого генома, однако вследствие многочисленных межхромосомных перестроек, произошедших в кариотипе гиббона, каждая библиотека маркирует несколько дискретных сегментов хромосом человека.
Одновременное мечение библиотек различными комбинациями флуорохромов формирует воспроизводимый чередующийся цветовой рисунок — своеобразный штрихкод каждой человеческой хромосомы. В отличие от обычной многоцветной FISH, при которой хромосома преимущественно окрашивается целиком одним цветом, RX-FISH создаёт внутрисегментную цветовую дифференцировку. Это позволяет определять происхождение фрагментов, локализовать точки разрыва и выявлять сложные транслокации, инверсии, делеции и вставки.
Обратное направление гибридизации — нанесение человеческих библиотек на метафазы гиббона — применяется преимущественно в сравнительной цитогенетике для изучения эволюции кариотипа, но не составляет диагностического принципа RX-FISH человеческих хромосом. Варианты с одновременной гибридизацией ДНК пациента и контрольной ДНК описывают сравнительную геномную гибридизацию: она оценивает дисбаланс числа копий, но не создаёт характерную межвидовую цветовую исчерченность хромосом.
| Метод | Используемые зонды | Мишень гибридизации | Основной диагностический результат |
|---|---|---|---|
| RX-FISH | Хромосом-специфичные библиотеки гиббона с комбинированным флуоресцентным мечением | Метафазные хромосомы человека | Многоцветный сегментарный рисунок, выявление структурных перестроек и точек разрыва |
| Обычная chromosome painting FISH | Библиотека последовательностей одной человеческой хромосомы | Метафазные хромосомы человека | Окрашивание всей хромосомы или её производных, выявление транслокационного материала |
| M-FISH | Набор человеческих хромосом-специфичных зондов | Метафазные хромосомы человека | Идентификация каждой хромосомы по индивидуальному интегральному цвету |
| SKY | Комбинации флуорохромов для всех человеческих хромосом | Метафазные хромосомы человека | Спектральное распознавание хромосом, особенно при сложном кариотипе |
| Метафазная CGH | Конкурентно меченные геномные ДНК пациента и контроля | Нормальные контрольные метафазные хромосомы | Обнаружение делеций и дупликаций по изменению соотношения флуоресценции |
| Межвидовое хромосомное окрашивание | Зонды одного биологического вида | Хромосомы другого вида | Установление синтенных участков и эволюционных перестроек кариотипа |
RX-FISH особенно информативна при анализе сложных и криптических структурных аномалий, недостаточно отчётливо различимых при стандартном GTG-бэндинге. Метод требует метафазных клеток и не предназначен для полноценного выявления точечных мутаций или малых субмикроскопических изменений. Результаты при необходимости уточняют локус-специфической FISH, хромосомным микроматричным анализом либо секвенированием генома. Следовательно, определяющим признаком метода является перенос многоцветных хромосомных библиотек гиббона на человеческий метафазный кариотип.