2) колцемида
3) цитрата натрия
4) демеколцина
Синхронизация культуры лимфоцитов достигается добавлением метотрексата — антагониста фолиевой кислоты. Он подавляет активность дигидрофолатредуктазы, нарушает образование восстановленных фолатов и тем самым тормозит синтез тимидилата и ДНК. В результате делящиеся клетки накапливаются преимущественно на границе G1/S или в ранней S-фазе клеточного цикла.
После удаления метотрексата и добавления тимидина происходит синхронное возобновление репликации ДНК и последующее вступление большого числа клеток в митоз. Это позволяет получить в культуре значительную долю клеток на сходных стадиях митоза и использовать метод для приготовления высокоразрешающих хромосомных препаратов, выявления мелких структурных перестроек и уточнения кариотипа.
Колцемид и демеколцин являются препаратами одного функционального ряда: они связываются с тубулином, нарушают формирование веретена деления и фиксируют клетки в метафазе. Поэтому их применяют для накопления митотических клеток непосредственно перед фиксацией, но они не обеспечивают синхронизацию клеточного цикла. Цитрат натрия оказывает гипотоническое действие и используется на этапе подготовки клеточной суспензии, вызывая набухание клеток и расправление хромосом.
| Вещество или этап | Основная мишень | Фаза или процесс | Результат в цитогенетическом исследовании |
|---|---|---|---|
| Метотрексат | Метаболизм фолатов, синтез тимидилата и ДНК | Блокада на границе G1/S или в ранней S-фазе | Синхронизация клеточного цикла после последующего отмывания и добавления тимидина |
| Тимидин | Пул дТМФ и восстановление синтеза ДНК | Выход клеток из блока после метотрексата | Синхронное продвижение клеток к митозу |
| Колцемид | Микротрубочки веретена деления | Метафаза | Накопление митотических клеток и предотвращение расхождения хромосом |
| Демеколцин | Микротрубочки; фармакологически аналогичен колцемиду | Метафазная остановка | Фиксация клеток для подсчёта и анализа хромосом, но не синхронизация цикла |
| Цитрат натрия | Осмотическое равновесие клеточной суспензии | Гипотоническая обработка | Набухание клеток и улучшение расправления хромосом на препарате |
| Фиксация метанолом и уксусной кислотой | Белки и мембранные структуры клетки | Завершение подготовки препарата | Сохранение морфологии хромосом для окрашивания и кариотипирования |
Таким образом, метотрексат воздействует на регуляцию клеточного цикла, а не только на финальную стадию митоза. Синхронизация повышает однородность цитогенетического материала и облегчает получение хромосом высокого разрешения. Препараты, нарушающие функцию веретена деления, следует отличать от синхронизирующих агентов: они останавливают уже вступившие в митоз клетки. Выбор реагента определяется этапом лабораторного протокола и требуемым качеством кариотипирования.