2) флуоресцентной гибридизации in situ
3) фракционирования геномной ДНК в агарозном геле
4) мультиплексной лигазо-зависимой амплификации зондов (+)
Мультиплексная лигазо-зависимая амплификация зондов (MLPA) позволяет выявлять заранее известные точковые варианты при использовании мутационно-специфических зондов. Метод основан на гибридизации двух частей зонда с соседними участками исследуемой ДНК и их последующем лигировании. Если изменённый нуклеотид расположен в области лигазного соединения, несовпадение последовательностей препятствует эффективной лигазе, вследствие чего соответствующий амплификационный продукт отсутствует или его пик значительно снижается.
После лигирования все зонды амплифицируются одной парой универсальных праймеров, а продукты различной длины разделяются методом капиллярного электрофореза. Сопоставление высоты или площади пиков с контрольными образцами позволяет одновременно анализировать множество геномных локусов. Наиболее широко MLPA применяется для диагностики экзонных делеций и дупликаций, однако специальные варианты методики, включая аллель-специфическую MLPA, пригодны для таргетного определения отдельных однонуклеотидных замен.
Важно учитывать, что MLPA не является универсальным методом поиска неизвестных точковых мутаций. Для полного анализа последовательности гена предпочтительны секвенирование по Сэнгеру или высокопроизводительное секвенирование. Диагностическая ценность MLPA в отношении однонуклеотидных вариантов зависит от того, предусмотрен ли конкретный вариант конструкцией используемого набора зондов.
| Метод | Основная диагностическая цель | Возможность выявления точковых вариантов | Ключевое ограничение |
|---|---|---|---|
| MLPA | Делеции и дупликации отдельных экзонов; известные варианты | Да, при использовании мутационно-специфического зонда | Не обнаруживает произвольные неизвестные замены |
| Хромосомный микроматричный анализ | Копийные изменения генома и участки потери гетерозиготности | Обычно нет | Недостаточное разрешение для единичной нуклеотидной замены |
| FISH | Анеуплоидии, транслокации, крупные делеции и амплификации | Практически нет | Определяет только крупные изменения в заданном локусе |
| Электрофорез геномной ДНК в агарозном геле | Оценка размера, целостности и примерного количества ДНК | Нет | Однонуклеотидная замена не изменяет видимую длину фрагмента |
| Секвенирование по Сэнгеру | Анализ последовательности отдельных генов или экзонов | Да | Ограниченная производительность при исследовании многих генов |
| Высокопроизводительное секвенирование | Одновременный анализ панелей генов, экзома или генома | Да | Требует сложной биоинформатической интерпретации и подтверждения отдельных находок |
Таким образом, положительный результат MLPA при точковой мутации обусловлен нарушением или обеспечением лигирования строго комплементарных частей зонда. Метод особенно полезен, когда необходимо одновременно исследовать известную нуклеотидную замену и изменения числа копий экзонов. Отсутствие сигнала должно оцениваться вместе с контролями качества и результатами других молекулярно-генетических исследований. При клинически значимом результате обычно рекомендуется подтверждение независимым методом, чаще секвенированием.