2) секвенирование ДНК по Сэнгеру
3) полногеномное секвенирование
4) GTG-анализ дифференциально окрашенных хромосом (+)
Классическим золотым стандартом диагностики хромосомных болезней является цитогенетическое исследование кариотипа с GTG-окраской (G-banding). Метод основан на обработке хромосом трипсином и последующем окрашивании по Гимзе, в результате чего формируется воспроизводимый рисунок светлых и тёмных полос. Сопоставление числа, размеров, формы и полосатости хромосом позволяет выявлять анеуплоидии, полиплоидии, крупные делеции и дупликации, инверсии, транслокации, а также некоторые варианты мозаицизма.
Для анализа обычно культивируют лимфоциты периферической крови и исследуют хромосомы в метафазе, когда они максимально спирализованы и хорошо различимы. Стандартное разрешение составляет примерно 400–550 полос на гаплоидный набор, что позволяет обнаруживать структурные перестройки размером в несколько мегабаз и более. Особенно важное преимущество кариотипирования — возможность одновременно оценить весь хромосомный набор и выявить сбалансированные перестройки, которые могут не сопровождаться потерей или приростом генетического материала.
Флуоресцентная гибридизация in situ применяется преимущественно для целевого поиска заранее предполагаемой аномалии и не заменяет полноценного анализа кариотипа. Секвенирование по Сэнгеру предназначено главным образом для анализа отдельных генов и небольших вариантов последовательности, а полногеномное секвенирование выявляет преимущественно изменения нуклеотидной последовательности и не является классическим методом оценки метафазных хромосом. Поэтому в рамках традиционной цитогенетической диагностики именно GTG-анализ рассматривается как референсный метод.
| Метод | Основная диагностическая задача | Что выявляет | Ключевое ограничение |
|---|---|---|---|
| GTG-кариотипирование | Обзорная оценка всего хромосомного набора | Анеуплоидии, полиплоидии, крупные структурные перестройки, сбалансированные транслокации и инверсии | Низшая разрешающая способность по сравнению с молекулярными методами; необходимы делящиеся клетки |
| FISH | Быстрое подтверждение конкретной хромосомной аномалии | Микроделеции, амплификации, отдельные транслокации и анеуплоидии при использовании соответствующих зондов | Исследует только выбранные локусы и не обеспечивает полного скрининга генома |
| Секвенирование по Сэнгеру | Проверка варианта в конкретном гене или фрагменте ДНК | Точечные варианты и небольшие инделы | Не предназначено для диагностики большинства числовых и крупных структурных аномалий хромосом |
| Полногеномное секвенирование | Масштабный поиск вариантов нуклеотидной последовательности | Однонуклеотидные варианты, небольшие инделы, часть структурных вариантов и изменений числа копий | Интерпретация крупных перестроек, повторов и мозаицизма может быть ограничена; метод не заменяет автоматически кариотипирование |
| Критерий числовой аномалии | Подсчёт хромосом в метафазной пластинке | Трисомия 21, моносомия X, полиплоидия и другие изменения плоидности | Небольшие делеции и дупликации могут оставаться нераспознанными |
| Критерий структурной аномалии | Сопоставление полос на гомологичных хромосомах | Делеции, дупликации, инверсии, транслокации и маркерные хромосомы | Для субмикроскопических изменений требуются FISH, хромосомный микроматричный анализ или секвенирование |
Кариотипирование имеет особое значение при подозрении на синдром Дауна, синдромы Шерешевского–Тернера и Клайнфельтера, множественные врождённые пороки развития, задержку психомоторного развития и нарушенное половое развитие. При бесплодии и привычном невынашивании беременности исследование также позволяет обнаружить сбалансированные перестройки у одного из родителей. При необходимости GTG-анализ дополняют FISH, хромосомным микроматричным анализом или секвенированием, поскольку эти технологии повышают разрешение исследования. Выбор метода определяется предполагаемым типом генетического дефекта и клиническим фенотипом пациента.