2) электрофоретического
3) гибридизационно-ферментного
4) иммунохроматографического
При выполнении ПЦР в режиме реального времени накопление амплифицированного фрагмента ДНК контролируют непосредственно во время каждого цикла реакции по изменению флуоресценции. Наиболее специфичный вариант основан на гибридизации флуоресцентно меченого олигонуклеотидного зонда с комплементарной последовательностью мишени. В процессе амплификации флуоресцентный сигнал возрастает пропорционально количеству образовавшегося продукта и регистрируется оптической системой амплификатора.
По кривой амплификации определяют пороговый цикл (Cq, или Ct) — номер цикла, на котором флуоресценция превышает установленный порог. Чем меньше значение Cq, тем больше исходное количество целевой нуклеиновой кислоты в образце, при условии сопоставимых условий реакции и адекватной калибровки. Поэтому гибридизационно-флуоресцентный метод обеспечивает не только качественное выявление мишени, но и ее относительную или абсолютную количественную оценку.
Электрофорез применяют преимущественно для визуализации продуктов конечной ПЦР после завершения реакции; он не позволяет непрерывно отслеживать амплификацию. Гибридизационно-ферментные системы требуют ферментативной метки и последующей цветной регистрации, а иммунохроматографические тесты основаны на взаимодействии антигенов и антител и не являются стандартным способом детекции продукта ПЦР в реальном времени.
| Метод детекции | Основной принцип | Когда регистрируется результат | Особенности |
|---|---|---|---|
| Гибридизационно-флуоресцентный | Гибридизация флуоресцентного зонда с целевой последовательностью и регистрация сигнала оптической системой | В каждом цикле амплификации | Высокая специфичность, расчет Cq/Ct, возможность количественной ПЦР |
| Флуоресцентный с интеркалирующим красителем | Связывание красителя с двухцепочечной ДНК и увеличение флуоресценции | В каждом цикле амплификации | Метод проще и дешевле, но менее специфичен; требуется контроль неспецифических продуктов и анализ кривой плавления |
| Электрофоретический | Разделение ампликонов в агарозном или полиакриламидном геле по размеру | После завершения реакции | Позволяет оценить наличие и размер продукта, но не осуществляет непрерывный мониторинг амплификации |
| Гибридизационно-ферментный | Гибридизация мишени с зондом, содержащим ферментативную метку, с последующей субстратной реакцией | После этапа амплификации и обработки образца | Сигнал обычно регистрируется колориметрически или хемилюминесцентно; не является типичным форматом real-time ПЦР |
| Иммунохроматографический | Иммунологическое связывание антигена или антитела на тест-полоске | После миграции образца по мембране | Быстрый метод для отдельных антигенов или антител, но не для непосредственного мониторинга амплификации нуклеиновой кислоты |
| Критерий положительного результата real-time ПЦР | Пересечение кривой флуоресценции с пороговой линией в валидном диапазоне циклов | Во время анализа амплификационной кривой | Интерпретация проводится с учетом отрицательного контроля, положительного контроля, внутреннего контроля и установленного порога Cq/Ct |
Таким образом, ключевым признаком real-time ПЦР является регистрация флуоресцентного сигнала синхронно с амплификацией, а не визуализация продукта после ее окончания. Гибридизация зонда с мишенью повышает аналитическую специфичность и позволяет отличать целевой ампликон от большинства неспецифических продуктов. Достоверность результата оценивают только вместе с контролями постановки, качеством выделения нуклеиновой кислоты и установленными лабораторией критериями Cq/Ct.