2) увеличение количества анализируемых клеток
3) дополнительное цитохимическое или флуоресцентное окрашивание (+)
4) дополнительный подсчет ретикулоцитов
Дополнительное цитохимическое или флуоресцентное окрашивание позволяет повысить специфичность распознавания патологических и незрелых лейкоцитов. В современных анализаторах применяют красители, связывающиеся с ДНК и РНК, а также оценивают интенсивность флуоресценции, размеры клеток, их внутреннюю структуру и зернистость. Эти параметры формируют отдельные клеточные кластеры на дифференцировочных диаграммах и позволяют выявлять бласты, атипичные лимфоциты, незрелые гранулоциты и другие популяции, подозрительные на гемобластоз.
Цитохимические реакции, например определение активности миелопероксидазы, дополнительно характеризуют направление дифференцировки клеток и помогают отличать миелоидные популяции от лимфоидных. Увеличение числа анализируемых клеток лишь уменьшает случайную статистическую погрешность и не обеспечивает идентификацию патологического клона; осмотическая резистентность и подсчёт ретикулоцитов имеют иные диагностические задачи. Поэтому обнаружение специфического флуоресцентного или цитохимического паттерна является основанием для формирования анализатором предупредительного флага и проведения подтверждающего исследования.
| Метод или параметр | Что оценивается | Значение при подозрении на патологические лейкоциты | Ограничения |
|---|---|---|---|
| Импедансный подсчёт | Изменение электрического сопротивления при прохождении клетки через апертуру | Определяет количество и приблизительный объём клеток | Недостаточно специфичен для различения бластов, атипичных лимфоцитов и зрелых клеток сходного размера |
| Оптическое светорассеяние | Размер клетки, её внутренняя структура и зернистость | Позволяет разделять основные популяции лейкоцитов и выявлять атипичные клеточные кластеры | Перекрытие характеристик разных клеточных популяций может вызывать ложные флаги |
| Флуоресцентное окрашивание нуклеиновых кислот | Содержание ДНК/РНК и интенсивность флуоресценции | Повышает выявляемость незрелых клеток, бластов и клеток с аномальным содержанием нуклеиновых кислот | Результат требует интерпретации с учётом морфологии и других параметров анализа |
| Цитохимическая реакция на миелопероксидазу | Активность фермента гранулоцитарно-миелоидного ряда | Помогает ориентировочно определить миелоидную направленность патологических клеток | Не заменяет иммунофенотипирование и не всегда позволяет классифицировать клеточную популяцию |
| Увеличение числа анализируемых клеток | Объём статистической выборки | Повышает воспроизводимость количественных показателей при низкой концентрации клеток | Не выявляет специфические морфологические или фенотипические признаки патологического клона |
| Подсчёт ретикулоцитов | Молодые формы эритроцитов, содержащие остаточную РНК | Характеризует эритропоэз и регенераторную активность костного мозга | Не предназначен для обнаружения патологических лейкоцитов |
| Микроскопия мазка и проточная цитометрия | Морфология и экспрессия антигенов клеточной поверхности или цитоплазмы | Подтверждают наличие бластов, атипичных клеток и определяют их линейную принадлежность | Назначаются после флага анализатора или при клиническом подозрении; требуют специализированной интерпретации |
Флуоресцентные каналы анализатора особенно информативны при выявлении клеток с повышенным содержанием нуклеиновых кислот, характерным для незрелых форм. Предупредительный флаг не является окончательным диагнозом и должен рассматриваться вместе с лейкоцитарной формулой, клиническими данными и результатами мазка периферической крови. При сохраняющемся подозрении на гемобластоз необходимы иммунофенотипирование методом проточной цитометрии, а при показаниях — цитогенетические и молекулярно-генетические исследования.