2) ионообменная
3) гель-фильтрационная (+)
4) газожидкостная
Гель-фильтрационная хроматография, или эксклюзионная хроматография по размеру, разделяет белки по их гидродинамическому объёму. Неподвижная фаза представляет собой пористый гель с заданным диапазоном размеров пор. Крупные молекулы не проникают в поры и проходят через колонку быстрее, тогда как более мелкие белки частично входят в поровое пространство, задерживаются дольше и элюируются позднее.
Метод одновременно применяют для мягкой очистки белков и ориентировочного определения их молекулярной массы, поскольку разделение обычно выполняется в условиях, сохраняющих нативную структуру и биологическую активность макромолекул. Для расчёта молекулярной массы строят калибровочную зависимость между объёмом элюирования стандартных белков известной молекулярной массы и их коэффициентом распределения в колонке. Наиболее точны результаты для белков с близкой к глобулярной формой; вытянутые молекулы, агрегаты и комплексы могут элюироваться иначе, чем сферические белки такой же массы.
Адсорбционная и ионообменная хроматография также используются при очистке белков, но основаны преимущественно на различиях в поверхностных взаимодействиях и заряде соответственно, поэтому сами по себе не дают прямой оценки молекулярной массы. Газожидкостная хроматография предназначена главным образом для летучих и термостабильных низкомолекулярных соединений и для белков непригодна.
| Метод | Основной механизм разделения | Возможность оценки молекулярной массы белка | Типичное применение |
|---|---|---|---|
| Гель-фильтрационная | Различия в гидродинамическом размере и доступности пор матрицы | Да, по калибровочной кривой; особенно надёжно для глобулярных белков | Очистка, фракционирование, оценка олигомерного состояния и агрегатов |
| Адсорбционная | Обратимое связывание с поверхностью сорбента за счёт гидрофобных, ван-дер-ваальсовых или иных взаимодействий | Нет прямой достоверной оценки; удерживание зависит от свойств поверхности белка | Разделение веществ по сродству к адсорбенту |
| Ионообменная | Электростатическое взаимодействие заряженных групп белка с противоположно заряженными группами матрицы | Нет; время элюирования определяется зарядом, pH и ионной силой | Высокоразрешающая очистка белков и разделение изоформ |
| Аффинная | Специфическое связывание белка с лигандом, антителом, субстратом или ко-фактором | Нет прямой оценки; метод основан на биологической специфичности | Селективное выделение целевого белка из сложной смеси |
| Гидрофобная | Взаимодействие гидрофобных участков белка с неполярными группами сорбента, усиливаемое высокой ионной силой | Нет; разделение зависит от поверхностной гидрофобности | Очистка белков, сохранение нативной конформации при подходящих условиях |
| Газожидкостная | Распределение летучего аналита между газовой подвижной и жидкой неподвижной фазами | Для интактных белков практически не применима из-за нелетучести и термолабильности | Анализ летучих органических соединений и производных низкомолекулярных веществ |
При интерпретации результатов учитывают объём свободного пространства колонки, общий объём элюции и диапазон фракционирования выбранного геля. Белки, размеры которых выходят за пределы рабочего диапазона матрицы, разделяются недостаточно эффективно. Появление раннего пика может указывать на высокомолекулярные агрегаты или комплексы, а поздний пик — на меньшие молекулярные формы. Поэтому гель-фильтрацию часто дополняют электрофорезом в денатурирующих условиях, масс-спектрометрией или другими методами точного определения молекулярной массы.