2) фиксированного антигена и меченого антитела (+)
3) фиксированного антигена и антитела
4) растворимого антигена и антитела
Иммуногистохимия основана на специфическом связывании антитела с антигеном, локализованным в клетках или межклеточном веществе гистологического среза. Антиген предварительно фиксируют в ткани, чтобы сохранить её морфологическую структуру и пространственное распределение молекулярных мишеней. Меченое антитело распознаёт соответствующий эпитоп антигена, а метка обеспечивает визуализацию реакции.
В прямом иммуногистохимическом методе диагностическое антитело непосредственно конъюгировано с ферментом или флуорохромом. При ферментной детекции используют, например, пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу; после добавления хромогена образуется окрашенный нерастворимый продукт, выявляемый в световом микроскопе. При иммунофлуоресцентном исследовании сигнал формируется флуорохромом и регистрируется в люминесцентном микроскопе.
Современные непрямые варианты также сохраняют этот принцип: сначала с антигеном связывается немеченое первичное антитело, затем его обнаруживает меченое вторичное антитело. Комплемент в стандартной иммуногистохимической реакции не является обязательным компонентом, а взаимодействие растворимого антигена с антителом характерно для иммунологических реакций в жидкой фазе, например преципитации или агглютинации. Поэтому наиболее точной формулировкой является взаимодействие фиксированного тканевого антигена с меченым антителом.
| Метод или компонент | Механизм выявления | Тип сигнала | Практическая характеристика |
|---|---|---|---|
| Прямой иммуногистохимический метод | Меченое первичное антитело непосредственно связывается с антигеном среза | Ферментный хромогенный или флуоресцентный | Быстрый и относительно простой, но менее чувствительный из-за отсутствия усиления сигнала |
| Непрямой иммуногистохимический метод | Первичное антитело связывает антиген, а меченое вторичное антитело — иммуноглобулин первичного антитела | Ферментный или флуоресцентный | Повышает чувствительность за счёт связывания нескольких вторичных антител с одним первичным |
| Полимерная система детекции | Меченый полимер одновременно связывает антитело и содержит большое количество ферментных молекул | Окрашенный продукт реакции с хромогеном | Высокая чувствительность и уменьшение фонового окрашивания по сравнению с традиционными усилительными системами |
| Иммунофлуоресценция | Антиген выявляется антителом, конъюгированным с флуорохромом | Свечение при возбуждении соответствующей длиной волны | Позволяет одновременно исследовать несколько антигенов при использовании разных флуорохромов |
| Ферментная детекция | Фермент, связанный с антителом или полимером, превращает хромоген в окрашенный продукт | Коричневый, красный или другой стабильный цветовой сигнал | Результат оценивают в обычном световом микроскопе; важно контролировать эндогенную активность ферментов |
| Антигенная демаскировка | Восстановление доступности эпитопов после фиксации и включения материала | Усиление специфического окрашивания | Проводится ферментативно или нагреванием; чрезмерная обработка может повредить морфологию и повысить фон |
| Контроль специфичности реакции | Сопоставление с положительным и отрицательным контролями | Наличие ожидаемого или отсутствие неспецифического сигнала | Необходим для интерпретации результата и исключения ошибок фиксации, реагентов и фонового окрашивания |
Интенсивность окрашивания сама по себе не является достаточным диагностическим критерием: учитывают локализацию сигнала, долю окрашенных клеток и соответствие морфологической картине. Результат интерпретируют с учётом качества фиксации, сохранности ткани и использованной системы детекции. Иммуногистохимическое заключение должно опираться на совокупность морфологических и иммунногохимических признаков, а не на изолированную реакцию одного маркера.