2) полимеразную цепную реакцию
3) определение нуклеотидной последовательности с помощью секвенирования (+)
4) полимеразную цепную реакцию в реальном времени
Генотип вируса определяется совокупностью наследственных признаков, закодированных в его нуклеотидной последовательности. Поэтому наиболее точным подходом является непосредственное установление порядка нуклеотидов в диагностически значимом участке или во всём геноме вируса с последующим сравнением полученной последовательности с референсными генотипами и филогенетическими базами данных. Такой анализ позволяет выявлять генотип, подтип, генетические варианты и мутации, имеющие диагностическое или прогностическое значение.
Секвенирование может выполняться методом Сэнгера для одного или нескольких фрагментов либо методом высокопроизводительного секвенирования нового поколения. После первичного получения данных проводят контроль качества, выравнивание последовательностей и биоинформатическую интерпретацию. Генотип устанавливают по совокупности специфических нуклеотидных замен и степени генетического сходства с эталонными последовательностями.
Иммуноферментный анализ выявляет антигены или антитела и обычно не предоставляет информации о генетической структуре вируса. Обычная ПЦР подтверждает наличие нуклеиновой кислоты, а ПЦР в реальном времени дополнительно позволяет количественно оценить вирусную нагрузку; генотипирование с их помощью возможно только при использовании строго специфичных праймеров или зондов. Однако такие методы ограничены заранее заданными мишенями, тогда как секвенирование непосредственно характеризует последовательность генома и потому является наиболее универсальным и точным способом генотипирования.
| Метод | Исследуемый материал или мишень | Основной результат | Возможность определения генотипа |
|---|---|---|---|
| Иммуноферментный анализ | Вирусные антигены или специфические антитела | Факт иммунологического ответа или наличие антигена | Как правило, не позволяет определить генотип |
| ПЦР | Специфический участок ДНК или кДНК вируса | Обнаружение генетического материала | Возможно только при использовании типоспецифичных праймеров; результат зависит от заранее выбранных мишеней |
| ПЦР в реальном времени | Амплифицируемая нуклеиновая кислота и флуоресцентный сигнал | Выявление и количественная оценка вирусной нагрузки | Генотипирование возможно при применении специфичных зондов, но метод не определяет полную последовательность |
| Секвенирование методом Сэнгера | Амплифицированный фрагмент вирусного генома | Точная последовательность нуклеотидов в исследуемом участке | Позволяет установить генотип или подтип при достаточной информативности фрагмента |
| Высокопроизводительное секвенирование | Множество фрагментов, потенциально охватывающих весь вирусный геном | Массовое получение последовательностей и выявление вариантов | Обеспечивает детальное генотипирование, включая смешанные инфекции и минорные варианты |
| Критерий подтверждения генотипа | Сравнение последовательности с референсными геномами | Выявление характерных замен и генетического расстояния | Генотип считается установленным при соответствии принятой системе классификации и валидированному алгоритму анализа |
Точность генотипирования зависит не только от метода, но и от качества выделения нуклеиновой кислоты, полноты исследованного участка и корректности биоинформатической интерпретации. При низкой вирусной нагрузке или наличии генетически неоднородной популяции вируса результаты требуют лабораторного контроля качества. Для клинически значимых выводов необходимо использовать валидированные наборы реагентов, референсные последовательности и стандартизированные критерии классификации. Полученный генотип может быть важен для прогноза заболевания, выбора терапии и эпидемиологического мониторинга.