2) денатурации (+)
3) лиофилизации
4) дегидратации
Денатурация — это нарушение нативной пространственной организации белковой молекулы: вторичной, третичной и, у олигомерных белков, четвертичной структуры. При этом пептидные связи обычно сохраняются, поэтому первичная структура остается относительно неизменной. Разрушаются водородные, ионные, гидрофобные и другие нековалентные взаимодействия, поддерживающие конформацию белка.
Изменение конформации приводит к утрате или снижению биологической активности: фермент теряет каталитическую функцию, рецептор — способность связывать лиганд, антитело — специфичность взаимодействия с антигеном. Денатурацию подтверждают изменением спектральных характеристик, растворимости, вязкости, электрофоретической подвижности, а главным функциональным критерием служит потеря специфической активности. В ряде случаев процесс обратим при устранении повреждающего фактора, однако выраженная денатурация часто сопровождается агрегацией и необратимым выпадением белка в осадок.
Электрофорез является преимущественно методом разделения и идентификации белков по заряду, размеру и форме и сам по себе не означает утраты их биологических свойств. Лиофилизация обычно применяется для стабилизации биологических препаратов путем замораживания и удаления воды в вакууме, а дегидратация обозначает удаление воды и может вызвать денатурацию лишь при неблагоприятных температурных, осмотических или химических условиях. Поэтому именно денатурация является процессом, непосредственно связанным с нарушением функциональных свойств белка.
| Процесс | Основное воздействие | Изменение структуры | Влияние на биологическую функцию | Типичный критерий оценки |
|---|---|---|---|---|
| Денатурация | Нагревание, изменение pH, действие органических растворителей, детергентов, тяжелых металлов | Нарушение вторичной, третичной и четвертичной структуры без обязательного разрыва пептидных связей | Снижение или утрата ферментативной, рецепторной, антигенной и иной специфической активности | Потеря активности, изменение спектра, растворимости или появление агрегации |
| Электрофорез | Миграция заряженных белковых молекул в электрическом поле | Разделение белков по электрофоретической подвижности; структура может сохраняться при нативных условиях | Не является обязательной причиной функциональной инактивации | Положение и интенсивность полос или фракций на электрофореграмме |
| Лиофилизация | Замораживание и сублимационное удаление воды под вакуумом | Обычно способствует сохранению нативной структуры; повреждение возможно при неправильном подборе крио- и лиопротекторов | Позволяет длительно хранить белковые препараты с сохранением активности | Стабильность препарата и сохранение функциональной активности после восстановления |
| Дегидратация | Удаление воды из белковой системы | Может временно стабилизировать белок или при жестких условиях нарушать его конформацию | Не всегда сопровождается утратой функции; эффект зависит от температуры, скорости и среды | Изменение активности после регидратации и восстановление растворимости |
| Гидролиз | Химическое или ферментативное расщепление пептидных связей | Разрушение первичной структуры с образованием пептидов и аминокислот | Необратимая утрата исходной белковой функции | Изменение молекулярной массы и появление продуктов расщепления |
Таким образом, денатурация отличается от простого удаления воды или аналитического разделения белков тем, что непосредственно нарушает их нативную конформацию. Потеря биологической активности обусловлена изменением пространственного строения активного центра или участка специфического связывания. При сохранении первичной структуры иногда возможно восстановление функции путем ренатурации, но агрегация белка обычно делает повреждение необратимым.