2) качественный и количественный анализ продуктов ПЦР с последующим электрофорезом в агарозном геле
3) только качественный анализ
4) качественный и количественный анализ продуктов ПЦР без стадии электрофореза (+)
ПЦР в реальном времени (qPCR) регистрирует накопление ампликона непосредственно в процессе циклов термоамплификации по увеличению флуоресценции. Для этого используют интеркалирующие красители, например SYBR Green, или специфические флуоресцентные зонды; сигнал фиксируется в закрытой реакционной пробирке, поэтому электрофорез как обязательный этап не требуется.
Качественный результат устанавливают по наличию или отсутствию специфического сигнала выше порогового уровня с учётом положительного, отрицательного и внутреннего контролей. Количественную оценку проводят по значению Cq/Ct — числу цикла, на котором флуоресценция пересекает заданный порог: чем меньше Cq/Ct, тем больше исходное количество целевой нуклеиновой кислоты. Абсолютную концентрацию определяют по калибровочной кривой стандартов, а относительное содержание — сравнением с референсным образцом или геном.
Таким образом, одна методика позволяет одновременно выявлять целевую последовательность и измерять её количество, что соответствует отмеченному ответу. Агарозный гель может применяться дополнительно для проверки размера ампликона или выявления неспецифических продуктов, особенно при использовании SYBR Green, однако в стандартном протоколе qPCR стадия электрофореза отсутствует.
| Подход | Принцип регистрации | Основной результат | Роль электрофореза |
|---|---|---|---|
| Обычная ПЦР с конечной точкой | Анализ продукта после завершения амплификации | Преимущественно качественное выявление мишени | Обычно необходим для визуализации полосы и оценки размера ампликона |
| qPCR с интеркалирующим красителем | Флуоресценция возрастает пропорционально накоплению двуцепочечного продукта | Качественный и количественный анализ | Не обязателен; может использоваться дополнительно для контроля специфичности |
| qPCR со специфическим зондом | Флуоресцентный сигнал возникает при гибридизации и расщеплении зонда в составе целевого ампликона | Высокоспецифичное качественное и количественное определение | Не требуется |
| Качественная интерпретация | Сравнение сигнала с порогом при корректных контрольных реакциях | Обнаружено или не обнаружено | Не требуется |
| Абсолютная количественная оценка | Сопоставление Cq/Ct исследуемого образца с калибровочной кривой стандартов | Концентрация копий, геном-эквивалентов или массы нуклеиновой кислоты | Не требуется |
| Относительная количественная оценка | Сравнение Cq/Ct мишени с референсным геном или контрольным образцом | Относительное изменение уровня нуклеиновой кислоты | Не требуется |
Ключевым аналитическим показателем эффективности реакции является корректная амплификационная кривая и воспроизводимость Cq/Ct. Для достоверной интерпретации учитывают эффективность амплификации, специфичность праймеров, наличие ингибиторов и результаты контролей. Закрытая система снижает риск контаминации ампликонами по сравнению с процедурами, требующими переноса продукта на гель. При мультиплексной qPCR несколько мишеней могут определяться одновременно по различающимся флуоресцентным каналам.