2) наличии галактоманнана
3) различиях pH компартментов клетки
4) эффекте смещения длины волны
Дифференциация бактерий при окраске по Граму основана главным образом на различиях строения и толщины пептидогликанового слоя клеточной стенки. У грамположительных бактерий этот слой развит значительно сильнее и после обработки спиртом или ацетоном удерживает комплекс кристаллического фиолетового с йодом, поэтому клетки остаются фиолетовыми. У грамотрицательных бактерий пептидогликановый слой тонкий, а наружная мембрана содержит липополисахарид; при обесцвечивании комплекс удаляется, после чего клетки окрашиваются контрастным красителем в розовый или красный цвет.
Ключевым этапом метода является обесцвечивание. Спирт разрушает липидный компонент наружной мембраны грамотрицательных бактерий и повышает проницаемость их клеточной стенки, тогда как у грамположительных клеток происходит дегидратация толстого пептидогликанового слоя, что препятствует выходу крас染ного комплекса. Поэтому различия pH внутриклеточных компартментов и эффект смещения длины волны не определяют результат окраски по Граму, а галактоманнан характерен преимущественно для клеточной стенки грибов и не является основой данной бактериологической дифференциации.
Результат микроскопии имеет диагностическое значение при первичной оценке возбудителя, выборе дальнейших питательных сред и ориентировочной антибактериальной терапии. Интерпретация должна учитывать возраст культуры, качество фиксации, толщину мазка и правильность времени обесцвечивания: нарушения методики могут привести к ложной грамвариабельности или неправильной окраске.
| Признак | Грамположительные бактерии | Грамотрицательные бактерии |
|---|---|---|
| Толщина пептидогликанового слоя | Толстый, многослойный | Тонкий, обычно один или несколько слоёв |
| Наружная мембрана | Отсутствует | Присутствует; содержит липополисахарид |
| Дополнительные компоненты клеточной стенки | Тейхоевые и липотейхоевые кислоты | Периплазматическое пространство, порины, липополисахарид |
| Поведение при обесцвечивании спиртом | Клеточная стенка уплотняется, комплекс кристаллического фиолетового удерживается | Наружная мембрана повреждается, красно-фиолетовый комплекс теряется |
| Окраска после контрастирования | Фиолетовая или синяя | Розовая или красная |
| Примеры | Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus | Escherichia coli, Neisseria, Pseudomonas |
Таким образом, правильный ответ связан с различиями количества и организации пептидогликана в клеточной стенке бактерий. Метод по Граму является дифференциальной окраской, а не определением конкретного вида микроорганизма. Для окончательной идентификации применяют культуральные, биохимические, масс-спектрометрические или молекулярно-генетические методы. Грамотрицательная окраска не заменяет исследование чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам.